海洋來源真菌Aspergillus sp.SCSIO 81-F2抗菌活性次級代謝產(chǎn)物的研究

羅明和，黃洪波，李沉紋，于彩平，馬俊英，盧來春*，鞠建華*

1 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶 400042;2中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)

重點實驗室中國科學(xué)院海洋微生物中心廣東省海洋藥物重點實驗室中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301

自上世紀(jì)50 年代從海洋來源的頭孢霉菌(Cephalosporium)分離得到頭孢菌素C 以來［1］，海洋真菌天然產(chǎn)物研究越來越受到人們的關(guān)注。海洋所獨具的低溫、高壓、高鹽、寡營養(yǎng)等特殊的環(huán)境，為海洋真菌產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的代謝產(chǎn)物提供了可能。目前從海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定的新化合物已經(jīng)超過1000 個，并且數(shù)量還在不斷增加;其結(jié)構(gòu)類型主要是聚酮類和生物堿，其次是萜類、肽類。人們從這些數(shù)量眾多的海洋真菌次級代謝產(chǎn)物中篩選到有藥用價值的、具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性的抗生素［2-4］。其中，Diketopiperazine halimide 最具有代表性，是由加州大學(xué)圣地亞哥分校的Fenical 研究小組發(fā)現(xiàn)的，它能抑制微管蛋白聚合，在此基礎(chǔ)上研發(fā)的該化合物的結(jié)構(gòu)類似物plinabulin(NPI-2358)正在進行治療非小細胞肺癌的臨床二期研究［5，6］。

本課題組在對南海海洋來源真菌活性次級代謝產(chǎn)物的持續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)了一些新的活性次級代謝產(chǎn)物:從海洋來源曲霉屬真菌Aspergillus sp.SCSIO F063 分離獲得了少見的氯代及溴代蒽醌［7］，從蟲草屬真菌Acremonium persicinum SCSIO 115 中分離獲得了具有細胞毒活性的環(huán)肽［8］，從炭角屬真菌Xylaria sp.SCSIO 156 中分離得到具有細胞毒活性的細胞松弛素［9］，從青霉屬真菌Penicillium sp.SOF 07中獲得了有免疫酶抑制劑活性的霉酚酸類化合物［10］。最近，我們發(fā)現(xiàn)一株南海海洋來源的真菌SCSIO 81-F2 的發(fā)酵產(chǎn)物對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis ATCC10792、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC29213 和大腸桿菌 Escherichia coli ATCC25922 具有抑菌活性。隨后，我們通過18S rDNA 序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，鑒定該菌株屬于曲霉屬真菌Aspergillus sp.。采用土豆培養(yǎng)基(PDB)發(fā)酵，利用抑菌活性追蹤與色譜層析技術(shù)相結(jié)合的方法從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得三個化合物，經(jīng)ESI-MS、1H/13C NMR 及X-單晶衍射分析鑒定為含異腈基的抗生素xanthocillin X dimethylether(1)、xanthocillin X monomethylether(2)、6'，8'-dimethoxy xanthocillin X dimethylether(3)。本文報道該菌株的分子生物學(xué)及由該菌株產(chǎn)生的異腈基類化合物的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker DRX 500 核磁共振儀(500/125 MHz，TMS 為內(nèi)標(biāo));Bruker amazon SL 離子肼質(zhì)譜儀;Oxford Gemini A Ultra X-單晶衍射儀;Varian ProStar 210 高效液相色譜儀(配PDA 檢測器);YMC-pack ODS-A 色譜柱(250×10 mm，5 μm);HS-GF254硅膠薄層板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司);色譜純乙腈(安徽時聯(lián)公司)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

海洋真菌SCSIO 81-F2 是從中國南海北部深海沉積土中分離純化而來，菌種保存于中國科學(xué)院海洋微生物研究中心。

PDA 培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯(200 g/L)，切成小塊，加水煮沸30 min，砂布過濾，取濾液加葡萄糖(20 g/L)，海鹽(30 g/L)，2 % 瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

PDB 培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基配方中不加瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋真菌81-F2 的分子生物學(xué)鑒定

1.2.1.1 18S rDNA 序列PCR 擴增

用真菌18S 通用引物，ITS1:(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4:(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')［11］，進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系(20 μL):DNA 模板1 μL，10×Buffer 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.6 μL，ITS1 primer(10 μmol/L)0.4 μL，ITS4 primer(10 μmol/L)0.4 μL，HiFi(5U/μL)0.2 μL，ddH2O 14.4 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72℃延伸40 s，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保溫。

1.2.1.2 擴增產(chǎn)物的序列測定

用凝膠回收試劑盒(OMEGA)純化PCR 產(chǎn)物，克隆至pCR2.1 載體(INVITROGEN)上，18S rDNA序列由美吉生物技術(shù)有限公司測定。將測得的18S rDNA 序列進行BLAST 分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過CLUSTAL X 軟件對海洋真菌菌株SCSIO 81-F2 及真菌中最相似菌株的18S rDNA 序列進行比對，使用軟件MEGA4.0 中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［12，13］。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

用250 mL 錐形瓶，每瓶加入50 mL PDB 培養(yǎng)基，從平板上接入海洋真菌81-F2 的菌絲體，于28℃、200 rpm 搖床上培養(yǎng)2 d 后分別轉(zhuǎn)入含200 mL PDB 培養(yǎng)基的1 L 錐形瓶中，于28 ℃、200 rpm 培養(yǎng)8 d。

1.2.3 抗菌活性檢測

取5 mg/mL 的樣品提取物DMSO 溶液5 μL，加到直徑為0.6 cm 無菌濾紙片上，置于生長有枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis ATCC10792、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC29213 和大腸桿菌Escherichia coli ATCC25922 的LB 檢測平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌活性。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的提取和分離

發(fā)酵產(chǎn)物(6 L)于4000 rpm 離心10 min，分離得到上清液和菌絲體。取上清液及菌絲體分別用乙酸乙酯和丙酮萃取得少量粗提物進行抑菌活性檢測，結(jié)果顯示菌絲體的萃取物有活性，上清液萃取物無活性。同時，HPLC 檢測發(fā)現(xiàn)菌絲體的提取物有次級代謝產(chǎn)物色譜峰，而上清液中未見。于是棄去上清液，將菌絲體用丙酮萃取3 次，經(jīng)減壓濃縮后得菌絲體粗提物總浸膏6 g。采用正相柱層析，氯仿-甲醇體系梯度(100∶0，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，90∶10，8∶2，5∶5，V/V)洗脫，得到Fr.1～Fr.8 共8 個餾份，餾份Fr.1，F(xiàn)r.2 有抑菌活性。對餾份Fr.1 用常壓正相硅膠柱層析，乙酸乙酯-石油醚梯度(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50，V/V)洗脫，反復(fù)純化3次，最后用二氯甲烷對較純產(chǎn)物重結(jié)晶得到化合物1。Fr.2 采用正相柱層析，氯仿-甲醇梯度(100∶0，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，9∶1，V/V)洗脫，經(jīng)HPLC 檢測分析合并Fr.2-(2-5)，再對Fr.2-(2-5)用半制備高效液相色譜(CH3CN/H2O 30%～100% 梯度洗脫20 min，流速2.5 mL/min)純化，得到化合物2(tR=15.5 min)、3(tR=19.4 min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

18S rDNA 序列分析表明菌株SCSIO 81-F2 與曲霉菌屬Aspergillus unguis DFFSCS009 及Aspergillus sp.SCSIOF063 菌株的18S rDNA 序列相似性較高，所以鑒定為Aspergillus sp.81-F2，其菌落形態(tài)見圖1，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖1 菌株SCSIO 81-F2 在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)圖Fig.1 Phenotype of strain SCSIO 81-F2 on PDA-medium plate

圖2 基于18S rDNA 序列構(gòu)建的SCSIO 81-F2 與其他真菌菌種NJ 分子系統(tǒng)進化樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 18S rDNA sequences showing relationships between strain SCSIO 81-F2 and closely related members of fungi

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色塊狀晶體，(+)ESI-MS 給出分子準(zhǔn)離子峰m/z 317.1［M+H］+、339.0［M+Na］+及655.3［2M+Na］+，據(jù)此推測化合物1 的分子量為316。13C NMR 譜僅顯示8 個C 信號，含一個低場區(qū)信號δC173.3，一個連氧芳碳信號δC161.1，五個芳碳信號，一個連氧脂肪碳信號δC55.4，提示該化合物存在對稱結(jié)構(gòu)。1H NMR 譜揭示4 處質(zhì)子信號δH7.79、6.99、6.98、3.86，其積分比為2∶1∶2∶3，因此，推測其分子式為C20H16N2O2。進而推斷13C NMR 譜中低場區(qū)碳信號δC173.3 可能為異腈基碳信號。再仔細分析1H NMR 譜信號，在低場區(qū)存在芳環(huán)的鄰位偶合系統(tǒng)δH7.79(d，J=8.5 Hz)、6.98(d，J=8.5 Hz)，推斷分子中可能含有對位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu);δH6.99(s)為孤立烯鍵質(zhì)子信號，說明分子中存在雙鍵;δH3.86(s)結(jié)合δC55.4 碳信號，推斷分子中存在甲氧基。經(jīng)查閱文獻［14］，與報道的xanthocillin X dimethylether 的波譜數(shù)據(jù)一致，故化合物1 鑒定為xanthocillin X dimethylether。經(jīng)培養(yǎng)獲得了化合物1 的單晶，進一步運用X-單晶衍射驗證了化合物1 的結(jié)構(gòu)(圖4)。

1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.79(4H，d，J=8.8 Hz，H-5，5';9，9')，6.99(2H，s，H-3，3')，6.98(4H，d，J=8.8 Hz，H-6，6';8，8')，3.86(6H，s，H-10，10');13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:173.3(C-1，1')，161.1(C-7，7')，131.7(C-5，5';9，9')，127.4(C-3，3')，124.8(C-4，4')，116.1(C-2，2')，114.4(C-6，6';8，8')，55.4(C-10，10')。

圖3 化合物1 的X-單晶衍射結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The X-ray structure of compound 1

化合物2 黃色粉末，(+)ESI-MS 給出分子準(zhǔn)離子峰m/z 303.0［M+H］+、325.0［M+Na］+、655.3［2M+Na］+，推測化合物2 的分子量為302，較化合物1 少14 個質(zhì)量數(shù)，推斷其分子式為C19H14N2O2?；衔? 的1H NMR 譜在低場區(qū)有δH7.78與6.99(J=8.9 Hz)，7.71 與6.92(J=8.7 Hz)兩對典型的苯環(huán)鄰位質(zhì)子偶合系統(tǒng)，δH6.98 處有一個呈單峰的烯氫信號，δH3.89 存在一個甲氧基質(zhì)子信號。13C NMR 給出15 個碳信號:低場區(qū)δC172.6，172.4 兩個碳信號，兩個連氧芳碳信號δC161.3 及159.5，10 個芳碳信號，以及一個連氧脂肪碳信號δC55.1。推斷化合物2 存在兩個對位取代苯環(huán)，兩個雙鍵，兩個異腈基，以及一個甲氧基，與化合物1 比較，少了一個甲氧基。經(jīng)查閱文獻［15］，與報道的波譜數(shù)據(jù)一致，故鑒定為Xanthocillin X monomethylether。

1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.78(2H，d，J=8.9 Hz，H-5，9)，7.71(2H，d，J=8.7 Hz，H-5'，9')，6.99(2H，d，J=8.9 Hz，H-6，8)，6.98(2H，s，H-3，3')，6.92(2H，d，J=8.7 Hz，H-6'，8')，3.89(3H，s，H-10);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:172.6(C-1)，172.4(C-1')，161.3(C-7)，159.5(C-7')，132.2(C-5'，9')，131.9(C-5，9)，128.3(C-3')，127.5(C-3)，125.1(C-4)，123.9(C-4')，116.4(C-2)，116.2(C-6'，8')，115.5(C-2')，114.7(C-6，8)，55.1(C-10)。

化合物3(+)ESI-MS 給出分子準(zhǔn)離子峰m/z 399.2［M+Na］+及775.2［2M+Na］+，因此化合物3 的分子量為376，推斷其分子式為C22H20N2O4。1H NMR 譜低場區(qū)給出苯環(huán)鄰位偶合體系的特征信號δH7.81(d，J=8.5 Hz)、6.99(d，J=8.5 Hz)，說明分子中存在對位取代苯環(huán)。1H NMR譜還給出呈單峰的烯氫信號δH7.08、7.06、7.00，積分比為2∶1∶1，提示分子中存在兩個雙鍵，以及一個1，3，4，5-四取代苯環(huán);另外還有甲氧基質(zhì)子信號δH3.93 和3.88，積分比為3∶1，推斷分子中存在4 個甲氧基。13C NMR 譜低場區(qū)δC173.9 和δC173.4 對應(yīng)兩個異腈基碳，高場區(qū)在δC61.0、56.3、55.5 有三個甲氧基碳信號，其中56.3 處的信號顯著偏高，為兩個碳原子。經(jīng)比對文獻數(shù)據(jù)［16］，發(fā)現(xiàn)與6'，8'-dimethoxy xanthocillin X dimethylether 的波譜數(shù)據(jù)一致，因此，化合物3 為6'，8'-dimethoxy xanthocillin X dimethylether。

1H NMR(CD3OD 500 MHz)δ:7.81(2H，d，J=8.5 Hz，H-5，9)，7.08(2H，s，H-5'，9')，7.06(1H，s，H-3)，7.00(1H，s，H-3')，6.99(2H，d，J=8.5 Hz，H-6，8)，3.88(3H，s，H-10)，3.93(9H，s，H-10'，11'，12');13C NMR(CDCl3125 MHz)δ:173.9(C-1)，173.4(C-1')，161.3(C-7)，153.3(C-6'，8')，140.0(C-7')，131.9(C-5，9)，131.8(C-3')，131.4(C-3)，128.2(C-4')，127.8(C-4)，127.4(C-2')，124.7(C-2)，114.5(C-6，8)，107.3(C-5'，9')，61.0(C-10')，56.3(C-11'，12')，55.5(C-10)。

圖4 化合物1、2、3 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structures of compounds 1，2 and 3

2.3 討論

Xanthocillin 最早于1950 從一株青霉Penicillium notatum Westling 的發(fā)酵產(chǎn)物中得到，并于1957年由Hagedorn 和Tonjes 確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)［17］。它們都帶有一個異腈基，具有很強的生物活性，是一類廣譜抗生素，能抑制大部分革蘭氏陰性和陽性菌以及部分真菌如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、酵母菌等的生長，并能抑制耐青霉素和磺胺類藥物的耐藥菌的生長。但是由于它在哺乳動物的胃腸中吸收很差，所以只能做成軟膏作為外用制劑使用。Xanthocillin 類化合物不具有溶血效應(yīng)，但是在劑量過大時會有神經(jīng)毒活性。報道最多的Xanthocillin X monomethylether 還能特異性的抑制花生四烯酸到前列腺素H2 的生物合成，它的衍生物對實體瘤也有很好的抑制活性，其成果已被日本的Hiroshi Kurihara 等申請專利保護［18，19］。另外有報道顯示Xanthocillin 作為促血小板生成素模仿物，能選擇性誘導(dǎo)c-Mpl-expressed UT-7 細胞的生長，極有可能開發(fā)成促血小板生成的新藥物，Xanthocillin X monomethylether 同時還能誘導(dǎo)一些蛋白的磷酰化［16］。本研究從一株海洋來源的真菌中分離獲得了Xanthocillin 類化合物，為該類化合物提供了新的來源，為其結(jié)構(gòu)改造和藥理藥效研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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