植物源脂肪酶抑制劑研究進(jìn)展

李 強(qiáng)，任 虹，王友升

北京工商大學(xué)食品學(xué)院 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048

肥胖癥(obesity)是指體內(nèi)脂肪積聚過多和(或)分布異常、體重增加，是由遺傳、環(huán)境等因素共同作用的慢性代謝性疾病。肥胖會(huì)引起高血壓、高血脂、糖尿病等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類的健康。脂肪酶抑制劑可抑制脂肪水解過程的關(guān)鍵酶胰脂肪酶的活性，減少食物中脂類物質(zhì)的消化和吸收，從而達(dá)到控制和治療肥胖的目的，目前，開發(fā)和應(yīng)用脂肪酶抑制劑作為減肥藥備受關(guān)注。目前脂肪酶抑制劑的主要來源是化學(xué)合成、微生物代謝產(chǎn)物和植物提取物?；瘜W(xué)合成的脂肪酶抑制劑對(duì)身體有不同程度的損傷，而天然來源的脂肪酶抑制劑具有結(jié)構(gòu)多樣、毒性低等特點(diǎn)。本文從脂肪酶活性的測(cè)定方法及脂肪酶抑制劑的結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行綜述，為高效低毒植物來源脂肪酶抑制劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 脂肪酶活性測(cè)定方法

1.1 對(duì)硝基苯酚法

對(duì)硝基苯酚法［1］是利用脂肪酶水解對(duì)硝基苯酚酯的產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚在420 nm 波長(zhǎng)下有最大吸收值，通過對(duì)照對(duì)硝基苯酚吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線得出對(duì)硝基苯酚濃度，計(jì)算出脂肪酶活力，對(duì)硝基苯酚法穩(wěn)定性好、精確度高。其計(jì)算公式為:

脂肪酶活力=VN(C-C0)/T/V1

式中，V-反應(yīng)總體積，N-稀釋倍數(shù)，C-樣品對(duì)硝基苯酚濃度，C0-空白對(duì)硝基苯酚濃度，T-反應(yīng)時(shí)間，V1-酶液的用量

1.2 熒光法

熒光法［2］測(cè)定脂肪酶活性是以4-甲基傘形酮油酯為底物，經(jīng)脂肪酶水解后產(chǎn)生4-甲基傘形酮在激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm 下有熒光強(qiáng)度，以每分鐘熒光強(qiáng)度的變化來表示脂肪酶活力，即熒光增長(zhǎng)曲線的斜率。熒光法精確度高，靈敏度高，是近年常用的一種方法。

1.3 橄欖油乳化法

橄欖油乳化法［3］測(cè)定脂肪酶活性的原理是乳化橄欖油經(jīng)脂肪酶水解成脂肪酸和甘油，利用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液對(duì)產(chǎn)物脂肪酸進(jìn)行酸堿滴定，通過耗堿量求出脂肪酶活力，滴定法所用儀器常見、操作簡(jiǎn)單，精確度較高，但由于酮酸的影響使結(jié)果偏大。其計(jì)算公式為:

脂肪酶活力=(V-V0)/t×m×n

式中，V-樣品消耗堿的體積，V0-空白消耗堿的體積，t-反應(yīng)時(shí)間，m-1mL 堿中所含的氫氧根微摩爾數(shù)，n-酶液稀釋倍數(shù)

1.4 比色法

1.4.1 銅皂法

銅皂法［4］測(cè)定脂肪酶活性的原理是脂肪酶的水解產(chǎn)物脂肪酸與顯色劑(5%的醋酸銅溶液用吡啶調(diào)pH 至6.1)中的銅離子反應(yīng)生成銅皂藍(lán)色絡(luò)合物在710 nm 波長(zhǎng)下有最大吸收值，通過對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出脂肪酸的濃度，從而計(jì)算出脂肪酶的活性，銅皂法操作相對(duì)復(fù)雜，由于金屬離子的干擾，影響到檢測(cè)的準(zhǔn)確性。其計(jì)算公式為:

脂肪酶活力=CV/TV1

式中，C-脂肪酶的濃度，V-脂肪酸/苯溶液的體積，T-作用時(shí)間，V1-酶液的用量

1.4.2 微乳液法

微乳液法是銅皂法的改良法，即在微乳液環(huán)境下，使脂肪酶水解產(chǎn)物脂肪酸與銅離子形成銅皂，經(jīng)苯萃取后進(jìn)行比色測(cè)定，其計(jì)算公式同銅皂法。該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但試劑價(jià)格偏高。

1.5 羅丹明平板法［5］

羅丹明B 能與脂肪酶水解的各種可能的底物(單、二油酸甘油酯，油酸，油酸鈉)結(jié)合為聚合體，該聚合體受紫外光激活，產(chǎn)生橘黃色熒光。依據(jù)有無橘黃色、顏色深淺和水解圈大小來判斷是否產(chǎn)脂肪酶和對(duì)所產(chǎn)脂肪酶活力大小進(jìn)行初步判斷。

2 植物來源的脂肪酶抑制劑

2.1 多酚類化合物

Eom 等［6］從褐藻中分離出6 種多酚類化合物(見圖1，化合物1～6)，采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定其脂肪酶抑制活性，6 種物質(zhì)對(duì)脂肪酶均有抑制作用，其中化合物2(fucofuroeckol A)和化合物3(7-phloroeckol)抑制活性較高，其IC50分別為37.2±2.3 和12.7±1.0 μM。Nakai 等［2］采用熒光法測(cè)定了茶葉中提取的54 種多酚類脂肪酶抑制活性(見圖1，化合物7～60)，發(fā)現(xiàn)烏龍茶中三種典型酯型多酚Oolonghomobisflavan A(化合物41)、Oolonghomobisflavan B(化合物43)和oolongtheanin 3'-O-gallate(化合物51)對(duì)脂肪酶活性有顯著抑制作用，其IC50分別為0.048、0.108 和0.068 μM;同時(shí)發(fā)現(xiàn)黃烷醇沒食子酸酯對(duì)脂肪酶抑制作用(IC50為0.098 μM)強(qiáng)于表沒食子兒茶素沒食子酸酯(IC50為0.349μM)，提出沒食子?；赡苁且种浦久富钚缘年P(guān)鍵基團(tuán)。Wu 等［7］從荔枝花中提取的多酚提取物具有較好脂肪酶抑制活性，當(dāng)多酚提取物濃度為7.0 mg/mL 時(shí)，脂肪酶抑制率為44.69%。動(dòng)物試驗(yàn)中，口服荔枝花多酚提取物可降低小鼠血脂濃度，減少小鼠脂肪肝的發(fā)生，減小腎周及附睪的脂肪組織。Cai等［8］采用對(duì)硝基苯酚法研究了燕麥多酚提取物對(duì)脂肪酶抑制作用，發(fā)現(xiàn)2.0 mg/mL 濃度下，脂肪酶抑制率達(dá)到80%。You 等［9］采用熒光法發(fā)現(xiàn)麝香葡萄及其葡萄籽中的多酚提取物可有效抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性，其對(duì)胰脂肪酶的IC50為8.63 mg/mL。McDougall 等［10］采用對(duì)硝基苯酚法研究了一系列漿果多酚提取物的體外脂肪酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)來源于極地莓、草莓、黃莓和樹莓的多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的脂肪酶抑制活性，其中黃莓提取物的半數(shù)有效濃度(EC50)為5 μg/mL，HPLC-MS 聯(lián)用技術(shù)分析表明其主要活性成分是鞣花單寧和原花青素。Thérèse Sergent 等［11］采用熒光法測(cè)定了多種植物多酚提取物的脂肪酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)其主要活性多酚物質(zhì)是縮合單寧成分，縮合單寧可以結(jié)合酶蛋白質(zhì)，使酶活性減低。

另外，來源于構(gòu)樹、水翁花、苦丁冬青苦丁茶中的多酚類物質(zhì)對(duì)脂肪酶活性也有顯著地抑制作用［12-14］。

2.2 皂苷類化合物

圖1 化合物1～60 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-60

Morikawa 等［15］研究了毛瓣無患子中13 種齊墩果烷型皂苷(見圖2，化合物61～73)的脂肪酶抑制活性，其中化合物61、62、63、64、66、67、68、69、71、72、73 均有較好的脂肪酶抑制活性，其IC50分別為151、131、172、130、166、125、121、125、117、100、129 μM。Yoshizumi 等［16］采用滴定法研究了短梗五加中的兩種羽扇烷型皂苷sessiloside(見圖2，化合物74)和chiisanoside(見圖2，化合物75)的脂肪酶抑制活性，其IC50分別為0.36、0.75mg/mL，高脂膳食小鼠喂食短梗五加皂苷提取物4 周，可有效抑制小鼠體重的增長(zhǎng)。此研究發(fā)現(xiàn)皂苷在抑制脂肪酶活性的過程中充當(dāng)了表面活性劑，使酶作用底物的表面性質(zhì)發(fā)生改變，降低了酶活性。Li 等［17］研究了刺五加中4 種三萜皂苷(見圖2，化合物76～79)的脂肪酶抑制活性，其IC50分別為0.22、0.25、0.26、0.29 mM。Zheng 等［18］采用比色法測(cè)定長(zhǎng)蕊絲石竹提取出的3 種三萜皂苷gypsosaponins A-C(見圖2，80-82)，在濃度為1mg/mL 下，脂肪酶活性抑制率分別為58.2%、99.2% 和50.3%。Kimura 等［19］采用熒光法研究了從日本七葉樹中提取的七葉樹皂苷(escins)及其衍生物去?；呷~樹皂苷(desacylescins)和去乙酰七葉樹皂苷(deacetylescins)的脂肪酶抑制活性，結(jié)果顯示三種皂苷均有較好的脂肪酶抑制活性，且escins 的抑制活性明顯大于其兩種衍生物的抑制活性，表明C-21 位酰基和C-22 位乙?；鶎?duì)皂苷的脂肪酶抑制活性有重要作用。此外，具有反式構(gòu)型的β 型七葉樹皂苷的活性大于順式構(gòu)型的α型的七葉樹皂苷的活性。Wu 等［20］研究了紫莖女貞苦丁茶中的麥角甾苷的脂肪酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)麥角皂苷對(duì)脂肪酶活性的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

另外，來源于茶葉、桔梗、薯蕷的皂苷也有脂肪酶活性抑制作用［21-23］。

2.3 萜類化合物

圖2 化合物61～82 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of compounds 61-82

Handa 等［24］從西伯利亞冷杉中分離出6 種具有脂肪酶抑制活性的三萜類化合物(見圖3，化合物83～88)，其中化合物85 和86 表現(xiàn)出較強(qiáng)的脂肪酶抑制活性，其IC50分別為0.51 和0.27 mM。Luyen等［25］采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定了杭白菊中分離出的倍半萜化合物10α-hydroxy-1α，4α-endoperoxy-guaia-2-en-12，6α-olide(見圖3，化合物89)對(duì)脂肪酶的抑制作用，其IC50為161.0μM。Yamada 等［26］分別研究了馬薄荷80%丙酮提取物、水提物和乙醚提取物的脂肪酶抑制活性，并從中分離出單萜化合物香芹酚(見圖3，化合物90)，其對(duì)脂肪酶的IC50為4.07mM。Dae Sik Jang 等［27］采用對(duì)硝基苯酚法研究軟棗獼猴桃根中6 種三萜類化合物(見圖3，化合物91～96)的脂肪酶抑制活性，結(jié)果表明，6 種化合物均有脂肪酶抑制活性，其中化合物91 的活性最高，其次為化合物92，其IC50分別為14.95、15.83μM。

圖3 化合物83～96 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of compounds 83-96

2.4 黃酮類化合物

Tao 等［28］采用熒光法測(cè)定荷葉中的3 種黃酮quercetin-3-O-β-D-arabinopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside，quercetin-3-O-β-D-glucuronide 以及kaempferol-3-O-β-D-glucuronide(見圖4，化合物97～99)的脂肪酶抑制活性，其IC50分別為66.86±7.07、94、135.01±68.30 μM。Se-Ra Won 等［29］采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定甘草根中的黃酮類化合物licochalcone A(見圖4，化合物100)的脂肪酶抑制活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)胰脂肪酶有非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制作用，Ki 為11.2 μg/mL，IC50為35 μg/mL。Shiv Kumar 等［30］發(fā)現(xiàn)高良姜莖中的高良姜黃素對(duì)脂肪酶活性有抑制作用，其IC50為48.20 mg/mL。此外，動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給高脂膳食雌性小鼠喂食50 mg/kg 高良姜黃素6周后，與對(duì)照組比較，高良姜黃素可有效抑制小鼠體重和子宮旁脂肪組織的增加，減少血液中甘油三酯的含量。

2.5 生物堿類化合物

圖4 化合物97～100 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of compounds 97-100

Rahul 等［31］測(cè)定了咖喱葉中4 種生物生物堿mahanimbin、koenimbin、koenigicine 以及clausazoline-K(見圖5，化合物101～104)的脂肪酶抑制活性，其IC50分別為17.9、168.6、428.6 和500 μM。荷葉具有降脂減肥的功能，其主要活性成分之一是生物堿，研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/mL 荷葉提取物對(duì)脂肪酶的抑制作用為11.25%，荷葉堿的抑制活性為25.77%，N-降荷葉堿的抑制活性為21.37%，O-降荷葉堿的抑制活性為24.63%，如表5 所示，抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，荷葉總生物堿能顯著降低高脂血癥大鼠的體質(zhì)量，顯著降低血清總膽固醇、血清甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇含量［32，33］。

2.6 其他

Watinee Chanmee 等［34］從黃果茄中分離得到具有脂肪酶抑制活性的甾醇類成分，還有學(xué)者研究了蘋果渣［35］、山楂［36］中的活性成分，如表1 所示。

圖5 化合物101～104 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structures of compounds 101-104

表1 植物來源的其他類型脂肪酶抑制劑Table 1 Others lipase inhibitors of plant origin

3 展望

近年國內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物源脂肪酶抑制劑進(jìn)行了大量研究，篩選出多種結(jié)構(gòu)新穎、活性特異的脂肪酶抑制劑，但其中的構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)理尚不明確，且很多植物中的活性成分含量較低，難以大量分離提取。因此，在尋找具有脂肪酶抑制活性的植物資源、獲得新型脂肪酶抑制的同時(shí)，明確其作用機(jī)理并通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)篩選更有效的抑制劑，或者對(duì)先導(dǎo)化合物利用生物化學(xué)方法進(jìn)行改造以獲得更穩(wěn)定高效的脂肪酶抑制劑成為今后研究的方向。

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