枯草芽胞桿菌B13液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

肖嫩群，曾 奧，成 壯，龔力民

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南省微生物研究院，湖南 長沙410009）

枯草芽胞桿菌B13液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

肖嫩群1，曾 奧2，成 壯1，龔力民1

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南省微生物研究院，湖南 長沙410009）

枯草芽胞桿菌B13是一種良好的微生態(tài)制劑原材料，為了增加枯草芽胞桿菌B13的芽孢產(chǎn)量，研究采用單因素試驗對接種量、培養(yǎng)時間、機械攪拌程度、裝液量和消泡劑添加量等發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，接種量0.5%，發(fā)酵液中添加4根玻璃棒和0.4%的豆油，裝液量為容器的1/10，37℃下以200 r/Mi n的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)8～48 h，可獲得較高濃度的菌體。

芽胞桿菌B13；液體發(fā)酵；培養(yǎng)條件

芽胞桿菌是一種抗逆性強、易于保存的工業(yè)生產(chǎn)用菌，同時具有產(chǎn)酶、抗菌、降解養(yǎng)分等多重功效[1-4]。土壤是芽胞桿菌的主要棲息場所，從土壤中分離芽胞桿菌是一條重要途徑。課題組于2004年從土壤中分離了一株芽胞桿菌，命名為B13。經(jīng)初步驗證，該菌可有效分解有機磷和無機磷，并對黃曲霉和煙草青枯病菌有拮抗作用。在此基礎(chǔ)上，對該菌株進行了生化和分子生物學鑒定，確定其為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）[5]。在培養(yǎng)基和土壤中進行解磷解鉀試驗，結(jié)果表明該菌在培養(yǎng)基和土壤中均能分解無機磷和有機磷；通過白菜盆栽和田間小區(qū)試驗對該菌株的功效進行評價，結(jié)果表明該菌株可提高白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，并對土壤理化性狀有一定的改良作用[6]。綜上所述，枯草芽胞桿菌B13具有非常好的應(yīng)用前景。因此，研究優(yōu)化枯草芽胞桿菌B13的液體發(fā)酵條件，以期為該菌株的進一步開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株 枯草芽胞桿菌B13，由課題組分離、篩選，能夠分解無機磷和有機磷，同時對煙草青枯病菌和黃曲霉具有明顯的抑制作用。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）菌種保存斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨斜面[7]。（2）種子液培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，水1 000ML，pH值7.0～7.2。（3）最佳培養(yǎng)基成分為：紅糖1%，麩皮1%，豆粕粉0.5%，尿素為1%，磷酸氫二鉀0.5%，水1 000ML，pH值7.0～7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 最佳接種量確定 按0.5%、1%、2%、4%、8%的接種量分別進行發(fā)酵，37℃搖床（200 r/Min）中振蕩培養(yǎng)48 h，在波長為660 nm的分光光度計上測其菌液OD值。每個處理重復3次，根據(jù)OD660值確定最佳接種量。

1.2.2 枯草芽胞桿菌B13的生長曲線 接種量為1%，培養(yǎng)條件同1.2.1，分別于培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h后取樣測菌液的OD660值，繪制枯草芽胞桿菌的生長曲線，以確定最佳培養(yǎng)時間。

1.2.3 機械攪拌對枯草芽胞桿菌生長的影響 在發(fā)酵三角瓶中分別加入0、1、2、4根2 cm長的玻棒，接種量為1%，培養(yǎng)條件同1.2.1，每個處理重復3次，根據(jù)OD660值判斷機械攪拌強度對供試菌生長的影響。

1.2.4 裝液量對枯草芽胞桿菌生長的影響 在250 ML三角瓶中分別裝入25、50、75、100ML培養(yǎng)基，滅菌后按1%接種量接種，培養(yǎng)條件同1.2.1，培養(yǎng)48 h后測其菌液OD660值，每個處理重復3次。

1.2.5 消泡劑對枯草芽胞桿菌生長的影響 在150 ML三角瓶中裝入50ML培養(yǎng)基，分別加入0、0.1%、0.2%、0.4%的植物油，接種量為1%，培養(yǎng)條件同1.2.1，培養(yǎng)48 h后測其菌液OD660值，每個處理重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳接種量

由圖1可知，隨著接種量的增加，枯草芽胞桿菌B13的OD660值表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢；其中，接種量為4.0%時，OD660值最低，僅0.076；而接種量為0.5%時，OD660值最高，為0.657；接種量在0.5%～4.0%的范圍內(nèi)，接種量與菌體產(chǎn)量呈負相關(guān)，接種量為4.0%～8.0%范圍內(nèi)，接種量與菌體產(chǎn)量呈正相關(guān)；平均OD660值由大到小排列依次為：0.5%＞1%＞8%＞2%＞4%。由此可知，枯草芽胞桿菌B13的最佳接種量為0.5%。

圖1 接種量對枯草芽胞桿菌B13生長的影響

2.2 枯草芽胞桿菌B13的生長曲線

從圖2中可以看出，枯草芽胞桿菌B13培養(yǎng)8 h后開始迅速增殖，至48 h發(fā)酵液OD660值達到最高，之后開始緩慢下降。由此推斷，8～48 h為枯草芽胞桿菌B13的最佳生長期。

2.3 機械攪拌對枯草芽胞桿菌B13生長影響

在發(fā)酵液中分別加入0～4根玻璃棒，已達到機械攪拌的目的。從圖3中可以看出，玻璃棒數(shù)量越多，枯草芽胞桿菌B13生長越好，生物量越大；其中，添加4根玻璃棒的處理，攪拌效果最好，其OD660值是未添加玻璃棒處理的11.3倍。這說明機械攪拌可顯著提高菌體量，其原因可能是機械攪拌能夠保障發(fā)酵液中的通氣量，從而促進菌體進行有氧呼吸，提高菌體產(chǎn)量。需要注意的是，并不是玻璃棒越多越好，機械攪拌過強容易損傷菌體，不利于菌體生長。

圖2 枯草芽胞桿菌B13的生長曲線

圖3 機械攪拌對枯草芽胞桿菌B13生長的影響

2.4 裝液量對枯草芽胞桿菌B13生長的影響

在250ML三角瓶中分別裝入25、50、75和100 ML培養(yǎng)液，接入1%的種子液，培養(yǎng)48 h后菌液OD660值分別為1.445、1.077、0.932和0.818。很明顯可以看出，菌體濃度隨著裝液量的增加而減少，以每瓶25ML的裝液量，菌體濃度最高。這也可證實了，通氣環(huán)境越好，對于芽胞桿菌B13這種好氧菌的生長越有利。但是在實際生產(chǎn)過程中，1/10的裝液量會導致整體產(chǎn)量降低、發(fā)酵液過度揮發(fā)、容器利用率低等問題，不利于節(jié)省生產(chǎn)成本和創(chuàng)造較高經(jīng)濟效益。

2.5 消泡劑對芽胞桿菌生長的影響

消泡劑的主要作用是消除發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫，避免逃液和染菌，保證發(fā)酵正常進行。發(fā)酵過程中常用的消泡劑為動植物油脂和一些化學合成的高分子化合物。該研究選用豆油作為消泡劑，在發(fā)酵液中分別添加0、0.1%、0.2%和0.4%的豆油，接入1%的種子液，培養(yǎng)48 h后菌液OD660值分別為0.739、0.844、1.135和1.405。這表明，在試驗設(shè)計的消泡劑添加量范圍中，豆油添加量與菌體濃度呈正相關(guān)關(guān)系，豆油最適添加量為0.4%。

3 討論

通過對枯草芽胞桿菌B13發(fā)酵條件的優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵條件為：接種量0.5%；菌體最適生長時期為8～48 h；在發(fā)酵液中放置4根玻璃棒，增加通氣量；裝液量為容器的1/10；豆油添加量為0.4%；37℃下以200 r/Min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。

枯草芽胞桿菌B13是一種良好的微生態(tài)制劑原材料[8]，要將菌體制成生物產(chǎn)品，進行工業(yè)化生產(chǎn)，就必須確定其最佳發(fā)酵條件。該試驗在實驗室內(nèi)對芽胞桿菌液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，目的就是為其應(yīng)用推廣提供基礎(chǔ)資料，有效降低生產(chǎn)成本。

惡劣環(huán)境下，一個細菌產(chǎn)生一個芽孢，條件適宜時重新成為一個細菌，數(shù)量沒有增加，因此芽孢不是細菌的繁殖體，而是一種休眠體，這對細菌的工業(yè)化應(yīng)用意義重大。不同細菌其芽孢產(chǎn)生的時期不同。但大多數(shù)細菌的芽孢是在生長穩(wěn)定后期產(chǎn)生，這個時期營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，加上代謝產(chǎn)物的增加，條件不適宜細菌生長。因此，芽孢也是一種自我保護措施。但也有報道稱某些細菌可能在生長前期就產(chǎn)生芽孢[9]，這可能與細菌個體的DNA有關(guān)的；同時，也有研究表明菌株形成芽孢與所需的供氧條件相關(guān)[10-11]，這可能與氧氣對芽孢形成影響的內(nèi)在機理有關(guān)；如何提高枯草芽胞桿菌B13發(fā)酵過程中芽孢的產(chǎn)量，有待于進一步研究。

[1]譚周進，周清明，肖啟明，等.芽胞桿菌B13功能的初步研究[J].微生物學通報，2005，32（5）：103-106.

[2]洪 斌，劉曉橋，陳紅漫.枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進展[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2006，22（1）：109-112.

[3]王 強，彭開松，嚴 兵，等.枯草芽孢桿菌源抗生素研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2010，31（9）：97-101.

[4]肖嫩群，謝果珍，龔力民，等.芽胞桿菌B13液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國微生態(tài)學雜志，2014，26（8）：883-886.

[5]周 靜，黃曉輝，肖冰梅，等.一株多功能芽孢桿菌的鑒定[J].中國微生態(tài)學雜志，2013，25（9）：997-1000.

[6]肖嫩群，黃曉輝，胡汝曉，等.芽胞桿菌B13對白菜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].中國微生態(tài)學雜志，2014，26（1）：27-30，33.

[7]趙 斌，何紹江.微生物學實驗[M].北京：科學出版社，2002.115-208.

[8] 肖嫩群，謝果珍，龔力民，等.芽胞桿菌B13解養(yǎng)分效果研究[J].中國微生態(tài)學雜志，2014，26（7）：764-766.

[9] KwakJW，KimKS，DeweyDY.ProductionofRosamicin：Improvement of synthdtic medium [J]. Applied and Enviromental Microbiology，1983，45（1）：350-353.

[10]王瑞霞.枯草芽孢桿菌B-903菌株的發(fā)酵條件及所產(chǎn)生抗生素的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學，2005.

[11]荊卓瓊.枯草芽孢桿菌B2發(fā)酵工藝及其復配研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2009.

（責任編輯：成 平）

OptiMization of Liquid Fermentation MediuMfor Bacillus B13

XIAONen-qun1，ZENG Ao2，CHENG Zhuang1，GONG Li-Min1
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,PRC;2.Hunan Institute of Microbiology,Changsha 410009,PRC）

Bacillus 13 is a favorable micro-ecological preparation.In order to improve the spore yield of Bacillus 13,the culture conditionsof Bacillussubtilis B13wereoptimized by single factorexperiments to investigate the effectof different inoculum,culture time, mechanicalagitation,liquid volume and defoamer additive.Results showed that the optiMized fermentation processwas as follows：The fermentation was carried out in vessel with ten percent liquid,0.5%seed culture,the optimuMbacteria age was 8～48 hours,glass rod number formechanicalagitationwas four,and incubated at37℃,220 r/Min.

Bacillus B13;liquid fermentation;culture condition

Q939.9

A

1006-060X（2015）04-0095-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.030

2014-04-21

湖南省科技廳項目（2014S K3016）

肖嫩群（1975-），女，湖南寧鄉(xiāng)縣人，實驗師，主要從事微生物生態(tài)學以及中藥材栽培等研究。

成 壯