shRNA抑制survivin基因表達對臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的影響*

馬 莎,林 俊,晉 松,李 芹,張 虹,王 靜

(云南省第一人民醫(yī)院風濕免疫科,昆明 650032)

論著·基礎(chǔ)研究

shRNA抑制survivin基因表達對臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的影響*

馬 莎,林 俊△,晉 松,李 芹,張 虹,王 靜

(云南省第一人民醫(yī)院風濕免疫科,昆明 650032)

目的 研究靶向存活素(survivin)的短發(fā)夾RNA真核表達質(zhì)粒(shRNA)對臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的影響。方法合成靶向survivin的shRNA真核表達質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至經(jīng)VEGF(50 ng/mL)處理的HUVEC細胞；轉(zhuǎn)染48 h后，采用實時定量聚合酶鏈反應(PCR)和蛋白印跡法檢測HUVEC中survivin的mRNA表達及蛋白水平。四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞增殖；TUNEL法檢測細胞凋亡。結(jié)果(1)survivin-shRNA質(zhì)粒試驗組與陰性對照shRNA質(zhì)粒組及空白對照組比較，轉(zhuǎn)染48 h后人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞survivin的mRNA及蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。(2)與陰性對照shRNA組及空白對照組比較，轉(zhuǎn)染后的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖能力明顯下降。轉(zhuǎn)染后24、48、72 h生長抑制率分別為(13.53±3.91)%、(38.97±1.82)%、(65.75±1.83)%，于轉(zhuǎn)染后72 h最為顯著。(3)試驗組凋亡率為(28.07±1.71)%，較陰性對照組(11.45±1.52)%和空白對照組(10.04±1.46)%顯著增高(P<0.05)。結(jié)論靶向survivin的shRNA質(zhì)粒能通過下調(diào)survivin表達，進而抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖并促進其凋亡。

血管內(nèi)皮生長因子；存活素；shRNA；增殖；細胞凋亡

存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis of protein,IAP)家族成員，是具有強大抗凋亡效應的蛋白[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEFG)可誘導survivin抗凋亡蛋白的表達，抑制內(nèi)皮細胞凋亡,促進血管生成[2]。深入認識和揭示survivin在介導VEGF促血管新生中的作用對尋找類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的基因靶向治療的方法具有重要意義。本試驗旨在通過轉(zhuǎn)染survivin-短發(fā)夾RNA真核表達質(zhì)料(shRNA)至人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)，觀察抑制survivin對外源性VEGF處理后HUVEC增殖及凋亡的影響，為RA基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(凱基生物公司)，VEGF165(美國Peprotech公司)，澳洲胎牛血清FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT)、DMSO(Sigma公司)，survivin兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)，GAPDH鼠抗人單克隆抗體(上海Abmart公司)，SYBR Green Master(Roch公司)、Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，shRNA-survivin表達質(zhì)粒載體及陰性對照質(zhì)粒載體(吉凱基因技術(shù)公司)，實時熒光定量PCR引物(Invitrogen公司)，蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測顯色法試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 外源性VEGF處理HUVEC HUVEC細胞系采用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基加雙抗，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。細胞生長密度至85%～90%，按1∶2比例進行傳代。轉(zhuǎn)染前24 h選擇對數(shù)生長期HUVECs細胞，按照6×105/孔接種至6孔板，每孔使用2 mL不含抗菌藥物的完全培養(yǎng)基，加入VEGF使其終濃度為50 ng/mL[3]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 shRNA載體轉(zhuǎn)染HUVEC 經(jīng)VEGF處理細胞24 h后將VEGF培養(yǎng)基棄去，PBS潤洗3次，每孔加入2 mL不含抗菌藥物完全培養(yǎng)基，設(shè)空白對照組(加入RPMI-1640培養(yǎng)基)、陰性對照組(加入negative-shRNA)、試驗組(加入survivin-shRNA)，靶序列為5′-AGA ATT AAC CCT TGG TGA A-3′，按照Lipofectamine 2000說明書進行，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞，呈GPF綠色熒光的細胞為轉(zhuǎn)染陽性細胞，計數(shù)4個高倍視野，轉(zhuǎn)染效率=陽性細胞數(shù)/總的細胞數(shù)×100%，根據(jù)轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測HUVEC中survivin mRNA表達 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA作為模板，采用SYBR熒光染料法進行實時定量PCR檢測各組mRNA表達，反應體系為25 μL,每個樣品分別設(shè)計3個重復。survivin上游引物：5′-GAC CAC CGC ATC TCT ACA TTC-3′，下游引物5′-TGC TTT TTA TGT TCC TCT ATG GG-3′；GAPDH的上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3′；實時定量PCR儀循環(huán)設(shè)置：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。用相對定量方法2-△△Ct值表示目的基因的mRNA水平[4]。

1.2.4 Western印跡法檢測survivin蛋白表達水平 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞并提取蛋白，BCA法測蛋白濃度。用15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠進行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，孵育survivin一抗(1∶2 000稀釋)和內(nèi)參GAPDH一抗(1∶10 000稀釋)，4 ℃過夜。TBST洗膜，用特異性辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶7 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜，顯色并于暗室曝光。Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行密度掃描，用Scion-Image軟件對圖像進行分析，測目的蛋白和內(nèi)參GAPDH蛋白的電泳條灰度值，以二者比值代表目的蛋白相對表達量。

1.2.5 MTT法檢測抑制survivin表達對HUVEC細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，轉(zhuǎn)染前24 h按5×103個/孔細胞接種至96孔板，其后按上述分組及96孔板說明參數(shù)進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 30 μL，37 ℃作用4 h，PBS洗滌2次，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光振蕩15 min使結(jié)晶充分溶解。在酶標儀測定490 nm波長下的吸光度(A)值。細胞生長抑制率(%)=(1-試驗組A值/空白對照組A值)×100%。

1.2.6 細胞凋亡分析 采用TUNEL法檢測細胞凋亡。接種細胞至爬片后按上述方法轉(zhuǎn)染及分組，培養(yǎng)48 h后收集細胞爬片，按說明書進行操作，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張爬片計數(shù)5個高倍鏡視野(×400)中的凋亡陽性細胞核數(shù)和總的細胞核數(shù)，凋亡率=陽性細胞核數(shù)/總的細胞核數(shù)計算細胞×100%，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 觀察轉(zhuǎn)染48 h后GFP綠色熒光標記細胞陽性率 觀察轉(zhuǎn)染48 h后HUVECs中GFP綠色熒光標記細胞陽性率，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中質(zhì)粒濃度為1.5 μg/mL時可獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率達到70%以上，見圖1。

A、B：試驗組；C、D：陰性對照組。

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后試驗組與陰性對照組細胞(倒置相差顯微鏡，×200)

表1 轉(zhuǎn)染48 h后各組檢測結(jié)果比較

2.2 實時熒光定量PCR檢測survivin mRNA的表達 轉(zhuǎn)染48 h后試驗組、陰性對照組、空白對照組survivin mRNA相對表達量見表1，試驗組顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01);陰性對照組與空白對照組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 Western blot檢測survivin蛋白的表達 轉(zhuǎn)染48 h后空白對照組、陰性對照組、試驗組survivin蛋白表達情況見圖2，相對表達量見表1。試驗組survivin蛋白表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，表達抑制率為56.7%;陰性對照組和空白對照組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 MTT法檢測各組細胞增殖活性結(jié)果 轉(zhuǎn)染24、48、72 h后各組A值見表2，實驗組細胞生長速度較空白對照組和陰性對照組均有不同程度減慢(P<0.01)，生長抑制率分別為(13.53±3.91)%、(38.97±1.82)%、(65.75±1.83)%，而陰性對照組與空白對照組細胞生長抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 各組HUVEC細胞survivin的蛋白表達量

表2 各組HUVEC細胞不同轉(zhuǎn)染時間MTT實驗檢測的A值比較

2.5 survivin-shRNA干擾HUVEC細胞后對其凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，試驗組細胞凋亡率為(28.07±1.71)%，與空白對照組(10.04±1.46)%和陰性對照組(11.45±1.52)%比較，試驗組細胞凋亡率明顯增加(F=164.32，P<0.01)。而陰性對照組與空白對照組間細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

血管翳是RA病變過程中一個特征性的病理表現(xiàn)，新生血管形成在RA的侵蝕和破壞過程中發(fā)揮了重要的作用并貫穿整個病程[5]。VEGF被認為是血管新生過程中的核心因子，其通過增加血管內(nèi)皮細胞有絲分裂，促進新生血管形成，并增加血管通透性及炎性物質(zhì)滲出，促進炎癥形成與發(fā)展[6]。VEGF及其受體在RA動物模型及RA患者的滑膜組織及血清中均高表達[7]。體外試驗也證明了關(guān)節(jié)炎的滑膜細胞能夠分泌較高水平的VEGF[8]。RA血清VEGF水平與疾病嚴重程度及并發(fā)癥的出現(xiàn)存在相關(guān)性[9]，同時抑制血管生成的藥物可有效緩解RA的病情[10]，腺病毒介導的反義VEGF基因轉(zhuǎn)染可有效減輕膠原關(guān)節(jié)炎癥狀，減輕滑膜血管翳對關(guān)節(jié)軟骨的破壞和病理改變[11]。然而，VEGF作為具有重要生理功能的細胞因子，抑制其表達也將帶來新的健康問題[12]。

survivin是IAP家族具有強大凋亡抑制效應的蛋白，survivin可以與VEGF相互作用，在VEGF誘導下，內(nèi)皮細胞中survivin表達增強，抑制內(nèi)皮細胞凋亡,促進血管生成[13]。survivin表達異常增高則促進VEGF誘導的內(nèi)皮細胞增殖和三維毛細血管網(wǎng)的形成[12]。采用反義技術(shù)使內(nèi)皮細胞survivin表達缺失，可抑制VEGF介導的內(nèi)皮細胞保護作用，促進內(nèi)皮細胞的凋亡和血管的退行性變，進而阻抑血管新生[3]。研究表明survivin在常見惡性腫瘤中表達，而在正常成熟的細胞和組織中無表達，這些研究使得通過抑制survivin表達來調(diào)控血管新生過程在治療RA成為可能。

本試驗通過VEGF處理HUVEC促進細胞增殖及上調(diào)survivin表達而模擬體外類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中血管新生狀態(tài)，構(gòu)建靶向survivin的shRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染經(jīng)外源性重組VEGF165處理的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞。轉(zhuǎn)染48 h后HUVEC中survivin的mRNA及蛋白表達水平明顯下降，試驗組mRNA相對表達量分別為(27.67±3.51)%，蛋白的相對表達量為0.74±0.05，表達抑制率為56.7%，顯著低于陰性對照組與空白對照組(P<0.01)，說明在一定程度上survivin-shRNA實現(xiàn)了對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞survivin基因的沉默，而陰性對照組shRNA對survivin的表達無影響。MTT法檢測細胞的增殖效應發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后試驗組細胞增殖的抑制于轉(zhuǎn)染48 h后出現(xiàn)，隨著時間的增加抑制效應遞增，72 h抑制達到高峰，生長抑制率為(65.75±1.83)%，實現(xiàn)了對HUVEC增殖的下調(diào)。轉(zhuǎn)染48 h后試驗組凋亡率為(28.07±1.71)%，較陰性對照組和空白對照組顯著增加(P<0.05)，證明下調(diào)survivin基因的表達可促進HUVEC細胞凋亡。

綜上所述，通過抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中survivin的表達可減少外源性VEGF促血管內(nèi)皮細胞增殖作用并促進細胞凋亡，推測survivin參與介導VEGF促血管生成過程，與Mesri等[3]的研究結(jié)果一致。提示在RA中抑制survivin基因的表達將在抑制類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管翳形成方面發(fā)揮作用，對RA有潛在的治療價值。下一步將借助survivin-shRNA載體上攜帶的抗性標記篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性HUVEC細胞，研究其在更長時間范圍的細胞生長特性及炎性因子分泌情況，為RA基因靶向治療奠定基礎(chǔ)。

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Effects of shRNA-mediated survivin silencing on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells*

MaSha，LinJun△，JinSong，LiQin，ZhangHong，WangJing

(DepartmentofRheumatoidandImmunology,theFirstPeople′sHospitalofYunnanProvince，Kunming,Yunnan650032，China)

Objective To investigate the effect of short hairpin RNA(shRNA) eukaryotic expression vector-mediated silencing of the survivin-gene on proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MethodsThe shRNA vector targeting the survivin gene and negative control vector were transfected into human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) incubated with 50 ng/mL of recombinant VEGF in vitro by lipofectamine 2000.Transfection after 48 h,the expression of survivin mRNA and protein was detected by quantitative real-time PCR and Western blot,respectively.HUVEC proliferation was assayed by four methylthiazolyl tetrazolium(MTT) and cell apoptosis was detected by TUNEL.Results(1)Transfection with survivin-shRNA vector significantly down-regulated the expression of survivin mRNA and protein as compared with the control group,after transfection of 48 h(P<0.05).(2)After survivin-shRNA vector transfected,the proliferation of HUVEC decreased significantly.After transfection 24,48,72 h,the growth inhibition rate were (13.53±3.91)%,(38.97±1.82)%,(65.75±1.83)% respectively,at 72 hours after transfection was the most significant.(3)The apoptosis rate of experimental group was (28.07±1.71)%,which was higher than the negative control group (11.45±1.52)% and blank control group (10.04±1.46)% (P<0.05).ConclusionThe shRNA-mediated mediated silencing of the survivin-gene could significantly inhibit proliferation and promote the apoptosis of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by regulating survivin expression．

vascular endothelial growth factor;survivin;short hairpin RNA;proliferation;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.008

云南省科技廳昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項基金資助項目(2011FB215)。

：馬莎(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事類風濕關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究?！?/p>

，Tel：13888906672；E-mail：linjun06@sina.com。

R593.22

A

1671-8348(2015)35-4922-03

2015-05-15

2015-07-22)