響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶協(xié)同提取沙棘籽粕原花青素的工藝研究

歐陽(yáng)健，金家宏，王洪倫

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001;2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;3 伽藍(lán)(集團(tuán))股份有限公司，上海 200233

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科沙棘屬植物，為灌木或喬木，青藏高原是沙棘的起源地，青海是沙棘的重要分布區(qū)。沙棘資源具有分布廣、品種多和耐旱強(qiáng)等特點(diǎn)，僅青海省內(nèi)，天然沙棘林面積5.3 萬(wàn)hm2，人工林面積7.3 萬(wàn)hm2，未成林造林面積達(dá)7.4 萬(wàn)hm2，具有很大的產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)潛力［1］。沙棘籽粕為沙棘籽超臨界CO2萃取油脂后的工業(yè)廢料，經(jīng)檢測(cè)其蛋白質(zhì)含量為20%，糖分為11.35%，脂肪為10.9%，總植物堿2.92 mg/kg，總黃酮502 mg/kg，另外還富含氨基酸、維生素等生物活性成分［2］。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［3-5］，沙棘具有抗腫瘤、抗心血管疾病和免疫調(diào)節(jié)等生物活性，尤其是沙棘中所含的原花青素類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等生理功能［6-9］。原花青素［10］是一類(lèi)具有特殊分子結(jié)構(gòu)的生物黃酮，是由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素結(jié)合形成的聚合物，其中2～5 倍體被稱(chēng)為低聚原花青素，大于5 倍體的稱(chēng)為高聚原花青素。體外藥理試驗(yàn)表明，原花青素是一種高效的抗氧化劑，它的抗自由基氧化能力是維生素E 的50 倍，維生素C 的20 倍，并且它在體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)達(dá)6.67±0.95 h［11，12］。原花青素類(lèi)化合物主要存在于大多數(shù)植物的果實(shí)、種子等組織中，對(duì)植物有著重要的保護(hù)作用［13］。沙棘果實(shí)被工業(yè)利用后的渣粕中仍含有較高的原花青素，以沙棘籽粕為原料研究原花青素的提取工藝，對(duì)沙棘資源的開(kāi)發(fā)具有一定意義。

目前，以沙棘籽粕為原料進(jìn)行原花青素的提取工藝研究較少，金海英［14］等研究了沙棘籽原花青素提取的單因素實(shí)驗(yàn)，張弛［15］等對(duì)沙棘果原花青素的分離純化進(jìn)行了研究，梅金龍［16］等研究了沙棘籽粕原花青素提取純化工藝。此外，禹華娟［17］等研究了蓮房原花青素的酶輔助提取工藝。纖維素酶協(xié)同超聲對(duì)沙棘籽粕原花青素的提取相關(guān)工藝未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬研究纖維素酶協(xié)同超聲提取沙棘籽粕原花青素的工藝，采用香草醛-鹽酸法［18］測(cè)定原花青素的含量并計(jì)算原花青素提取得率。通過(guò)單因素及響應(yīng)面法對(duì)原花青素的提取工藝進(jìn)行篩選優(yōu)化，為沙棘籽粕原花青素的生產(chǎn)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

沙棘籽粕，于2013年取自青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰咎崛∽延秃笞哑?兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司;纖維素酶，BBL 公司，酶活力15000 U/g。

UV-759 型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)、PHS-3C 型pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;優(yōu)普超純水器，成都超純水有限公司;超微粉碎機(jī)，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠。

甲醇、鹽酸、香草醛均為分析純，天津百世化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料制備

將沙棘籽粕粉碎過(guò)60 目篩，得到試驗(yàn)材料，放置于冰箱冷凍備用。

1.2.2 原花青素含量的測(cè)定［18］

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

配制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為1.2 mg/mL。分別量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，然后定容至10 mL。準(zhǔn)確量取各濃度兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，加入1%香草醛甲醇溶液2.5 mL 和8%鹽酸甲醇溶液2.5 mL，搖勻，避光，在30±1 ℃下，恒溫水浴保持30 min 后取出，用分光光度法在500 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光值，得回歸方程為y=0.38x +0.02，R=0.9994，線(xiàn)性范圍為0.12～0.62 mg/mL。

1.2.2.2 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g 左右沙棘籽粕粉末，加入一定體積的甲醇，按各方案進(jìn)行提取后，4000 rpm 離心15 min，取上清1.0 mL，按上述測(cè)定方法進(jìn)行保溫比色，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程對(duì)原花青素提取得率進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

該研究通過(guò)料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、酶的用量和提取液pH 等因素的試驗(yàn)結(jié)果，篩選出對(duì)沙棘籽粕原花青素提取工藝影響較大的因素，進(jìn)行Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過(guò)程中，設(shè)置不同的料液比，在室溫下，甲醇溶液超聲輔助提取45 min，研究料液比對(duì)原花青素提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1A。原花青素的提取得率隨著料液比的增加而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其中料液比為1∶30 g/mL 時(shí)，原花青素提取得率較高，而后變化趨勢(shì)不明顯。因此選取料液比1∶30 g/mL 進(jìn)行其他單因素試驗(yàn)。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過(guò)程中，設(shè)置不同的提取時(shí)間，在室溫下，料液比為1∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取，研究提取時(shí)間對(duì)原花青素提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1B。原花青素的提取得率隨提取時(shí)間的增加有一定的增加，45 min 前變化趨勢(shì)較為明顯，而后變化趨于平緩。因此，選擇甲醇超聲輔助提取時(shí)間45 min、料液比1∶30 g/mL 進(jìn)行其他單因素試驗(yàn)。

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過(guò)程中，考慮不同的提取次數(shù)，在室溫下，料液比為1∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取45 min，研究提取次數(shù)對(duì)沙棘籽粕原花青素提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1C。原花青素的提取得率對(duì)提取次數(shù)的增加有一定的變化，但變化趨勢(shì)較為不明顯，尤其是提取3 次以上幾乎無(wú)差異，因此，甲醇超聲輔助提取3 次、每次45min、料液比1∶30 g/mL 進(jìn)行其他單因素試驗(yàn)。

2.1.4 酶的用量對(duì)沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

試驗(yàn)選用纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取沙棘籽粕中的原花青素，考慮不同纖維素酶的用量，在室溫下，料液比為1 ∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取45 min，研究酶的用量對(duì)沙棘籽粕原花青素提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1D。沙棘籽粕中，原花青素需突破細(xì)胞壁的束縛才能進(jìn)入提取溶劑中，細(xì)胞壁的主要成分之一即為纖維素，它在纖維素酶的催化作用下，可快速降解，使細(xì)胞壁出現(xiàn)裂解的現(xiàn)象，使原花青素更易進(jìn)入提取溶劑中，提高其提取得率［19］。試驗(yàn)結(jié)果表明，在纖維素酶的作用下，原花青素的提取得率有明顯的提高，但當(dāng)酶的用量達(dá)到3%(每1 g 原料添加0.03 g 纖維素酶，下同)后，原花青素的提取得率無(wú)明顯變化。因此，選擇甲醇超聲輔助提取3 次、每次45 min、料液比1∶30 g/mL 和酶的用量為3%進(jìn)行其他單因素試驗(yàn)。

2.1.5 提取液pH 對(duì)沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

試驗(yàn)選用纖維素酶協(xié)助甲醇超聲提取沙棘籽粕中的原花青素，而酶活力容易受到pH 影響。因此，在提取過(guò)程中，考慮提取液pH，在室溫下，甲醇超聲輔助提取3 次、每次45 min、料液比1∶30 g/mL 和酶的用量為3%，研究提取液pH 對(duì)沙棘籽粕原花青素提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1E。試驗(yàn)表明，當(dāng)pH 小于3或大于7 時(shí)，原花青素的提取得率均處于較低水平，而當(dāng)pH 為5 時(shí)，原花青素的提取得率最高，且表明pH 對(duì)原花青素提取得率影響較大，其原因可能與提取液pH 對(duì)纖維素酶的影響有關(guān)，纖維素酶的最佳pH 在4.0～5.5 之間［20］。當(dāng)提取液pH 過(guò)酸和過(guò)堿，均使纖維素酶不能具有較高的催化效率，而影響原花青素的提取得率。

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 分析單因素結(jié)果顯示

甲醇超聲輔助提取3 次、酶的用量為3%時(shí)沙棘籽粕原花青素有最大的提取率。沙棘籽粕原花青素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)合Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，按照表1 對(duì)提取時(shí)間、料液比和提取液pH 作變換，以原花青素提取得率為響應(yīng)值(Y)，共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中1～12 組為析因試驗(yàn)，13～17 組為中心試驗(yàn)，用來(lái)分析試驗(yàn)誤差。

表2 原花青素提取得率試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis for the optimization of extraction conditions of PC

采用Design Expert 8.05b 軟件對(duì)沙棘原花青素提取得率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得回歸方程:原花青素提取得率Y=3.08+0.080X1+0.068X2+0.16X3+2.5 ×10-3X1X2-0.027X1X3-2.5 ×10-3X2X3-。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of regression analysis

2.2.2 模型的顯著性檢驗(yàn)

從回歸模型方差分析(表3)可見(jiàn)，試驗(yàn)選用的模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著P=0.1066＞0.05，說(shuō)明模型是適合的;模型的校正決定系數(shù)=0.9961，說(shuō)明該模型能解釋99.61%響應(yīng)值的變化，僅有總變異大約0.39%不能用該模型進(jìn)行解釋;相關(guān)系數(shù)R2=0.9983，說(shuō)明該模型擬合程度較好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小，可以用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)沙棘籽粕原花青素的提取得率。

由表3 方差分析結(jié)果可知，在此試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，一次項(xiàng)X1、X2、X3均極顯著(P＜0.01)，二次項(xiàng)X1X2、X2X3、X1X3均不顯著(P＞0.05)，均極顯著(P＜0.01)。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

回歸模型的響應(yīng)面及其等高線(xiàn)見(jiàn)圖2，3 組圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。由三組圖對(duì)比可知，提取液pH(X3)對(duì)沙棘籽粕原花青素提取得率影響最為顯著，表現(xiàn)為圖2B1、2C1 的曲面較陡。等高線(xiàn)的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形則相反。由圖2B2、2C2等高線(xiàn)可得知，提取時(shí)間與pH 值和料液比與pH 值的交互作用較為明顯，表現(xiàn)為等高線(xiàn)略成橢圓形。相比而言，提取時(shí)間與料液比之間的交互作用稍弱。

圖2 提取時(shí)間(X1)與料液比(X2)、提取時(shí)間(X1)與提取液pH(X3)及提取時(shí)間(X1)與提取液pH(X3)交互作用響應(yīng)面圖(A1、B1、C1)與等高線(xiàn)圖(A2、B2、C2)Fig.2 Responsive surface plots (A1、B1、C1)and contour plots (A2、B2、C2)showing the mutual effects of extraction duration(X1)and ratio of solid to liquid (X2)，extraction duration (X1)and pH value of extraction solvent (X3)，ratio of solid to liquid (X2)and pH value of extraction solvent (X3)on the yield of PC

2.2.4 最優(yōu)提取工藝參數(shù)

通過(guò)Design-Expert8.05b 軟件求解回歸方程得出的最佳提取工藝參數(shù)為:纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時(shí)間54.02 min，料液比32.01 g/mL，pH 值為5.31 提取3 次，測(cè)定并計(jì)算原花青素提取得率。綜合考慮試驗(yàn)的操作性、效率和成本等，將沙棘籽粕原花青素提取工藝參數(shù)修正為:纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時(shí)間55 min，料液比1∶30 g/mL，pH 值為5.0，提取3 次，此條件下，沙棘籽粕原花青素提取得率的理論值達(dá)到3.09%。

2.2.5 試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證和比較

按照模型得到的最優(yōu)提取參數(shù)與實(shí)踐過(guò)程中的簡(jiǎn)便性得到的最終條件驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。試?yàn)結(jié)果表明，模型提取參數(shù)按實(shí)際操作簡(jiǎn)化后實(shí)際提取得率為(3.07±0.0080)%，與理論最大值非常接近，說(shuō)明該模型可以較好的反映沙棘籽粕原花青素的提取參數(shù)，也說(shuō)明用響應(yīng)面法對(duì)原花青素提取得率進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

利用纖維素酶協(xié)同甲醇超聲輔助提取沙棘籽粕原花青素，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出料液比、提取時(shí)間和提取液pH 值對(duì)原花青素提取得率的影響較為明顯，進(jìn)一步根據(jù)Box-Benhnken 原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化沙棘籽粕原花青素提取的最佳工藝參數(shù)，并進(jìn)行穩(wěn)定性的檢驗(yàn)。根據(jù)響應(yīng)面分析模型方程Y=3.08+0.080X1+0.068X2+0.16X3+2.510-3，得出沙棘籽粕原花青素的最佳提取工藝參數(shù):纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時(shí)間55 min，料液比1∶30 g/mL，pH 值為5.0，提取3 次。在此條件下，沙棘籽粕原花青素提取得率為3.07%。該研究通過(guò)單因素及響應(yīng)面法對(duì)原花青素的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，為沙棘籽粕中原花青素的生產(chǎn)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 Chen XW(陳修文)，Zhao HL(趙宏利).Development and utilization of sea buckthorn resources in qinghai province.Nat Res(自然資源)，1992，6:47-51.

2 Wu AH(武挨厚)，Mi L(米拉)，Dong QJ(董交其)，et al.Nutritive value of Hippophae rhomnoides fruit residue and its application.J Inner Mongolia Instit Agric Animal Husb (內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院學(xué)報(bào))，1993，1:50-54.

3 Gao X，Ohlander M，Jeppsson N，et al.Changes in antioxidant effects and their relationship to phytonutrients in fruits of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.)during maturation.J Agric Food Chem，2000，48:1485-1490.

4 Suryakumar G，Gupta A.Medicinal and therapeutic potential of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.).J Ethnopharmacol，2011，138:268-278.

5 Panossian A，Wagner H.From traditional to evidence-based use of Hippopha? rhamnoides L.:chemical composition，experimental，and clinical pharmacology of sea buckthorn berries and leaves extracts.Evid Rational Based Res Chin Drugs，2013:181-236.

6 Al-malki AL，Sayed AAR，El Rabey HA.Proanthocyanidin attenuation of oxidative stress and NF-κB protects apolipoprotein E-deficient mice against diabetic nephropathy.Evid-Based Comple Alter Med，2013，2013:1-8.

7 Gentile C，Allegra M，Angileri F，et al.Polymeric proanthocyanidins from Sicilian pistachio (Pistacia vera L.)nut extract inhibit lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW 264.7 cells.Eu J Nutri，2012，51:353-363.

8 A-sowayan NS，Kishore U.Prophylactic efficacy of a combination of proanthocyanidin and vitamin E on hepatotoxicity induced by doxorubicin in rats.Int J Pharm，2012，2:161-169.

9 Shin MO，Yoon S，Moon JO.The proanthocyanidins inhibit dimethylnitrosamine-induced liver damage in rats.Arch Pharmacol Res，2010，33:167-173.

10 Hummer W，Schreier P.Analysis of proanthocyanidins.Mole Nutri Food Res，2008，52:1381-1398.

11 Bagchi D，Garg A，Krohn R，et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E，and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro.Res Commun Mole Pathol Pharmacol，1997，95:179-189.

12 Stoupi S，Williamson G，Viton F，et al.In vivo bioavailability，absorption，excretion，and pharmacokinetics of［14C］procyanidin B2 in male rats.Drug Metabol Dispos，2010，38:287-291.

13 Deprez S，Brezillon C，Rabot S，et al.Polymeric proanthocyanidins are catabolized by human colonic microflora into lowmolecular-weight phenolic acids.J Nutri，2000，130:2733-2738.

14 Jin HY(金海英).Single-factor tests extraction of proanthocyanidins from Hippophae rhamnoides seed.Hippophae(沙棘)，2006，18(4):29-32.

15 Zhang C(張馳)，Xu XY (徐曉云)，Pan SY (潘思軼).Study on isolation and purification of procyanidins from seabuckthorn Fruit.Food Sci (食品科學(xué))，2005，26:183-185.

16 Mei JL (梅金龍)，Hu CY(胡長(zhǎng)鷹)，et al.Extraction and purification of procyanidine from sea buckthorn seed meal.China Oils Fats(中國(guó)油脂)，2010，7(35):50-53.

17 Yu HJ (禹華娟)，Sun ZD (孫智達(dá))，Xie BJ (謝筆鈞).Enzyme assistant extraction of procyanidins from seedpod of lotus and the comparison of antioxidant activity.Nat Prod ResDev (天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2010，22:154-158.

18 Li CY (李春陽(yáng))，Xu SY (許時(shí)嬰)，Wang Z (王璋).Vanillin-HCl assay for the proanthocyanidins content of grape seed and stem.Food Sci (食品科學(xué))，2004，35:157-161.

19 Pettersson G.Structure and function of a cellulase fromPenicillium notatum as studied by chemical modification and solvent accessibility.Arch Biochem Biophysics，1968，126:776-784.

20 Ingram L，Gomez P，et al.Metabolic engineering of bacteria for ethanol production.Biotechnol Bioeng，1998，58:204-214.