蛋白性半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)及在魚類中的研究進(jìn)展

李樹紅，蔣然然，馬璐陽

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(Cysteine proteinase inhibitors，CPIs)，是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸(CySH)殘基的蛋白酶水解作用的抑制因子［1］。最近十幾年內(nèi)，在蛋白性CPIs 領(lǐng)域的研究取得了顯著的進(jìn)展。雖然上世紀(jì)60年代以來發(fā)現(xiàn)的Cystatins 仍然是目前鑒定的最徹底的一個(gè)超家族，但是近些年來個(gè)別新的大家族或一些較小的家族也陸續(xù)得到鑒定。事實(shí)是，CPIs 廣泛分布在動(dòng)植物體內(nèi)，且只要有蛋白酶參與的反應(yīng)中，都會(huì)有蛋白性的調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)。因此，CPIs 在蛋白的分解代謝、生物防御、感染與免疫、癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡等各生理或病理過程中都發(fā)揮著重要作用。然而，目前對(duì)魚類CPIs 的鑒定工作尚不完善，其潛在的活性、功能也有待進(jìn)一步深入研究。因此，本文在介紹了動(dòng)植物源CPIs 的類群組成，結(jié)構(gòu)特征、抑制機(jī)制及其活性、功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步系統(tǒng)地綜述了魚類來源的各種CPIs 的純化、鑒定、潛在的活性及功能，并展望了其應(yīng)用前景。

1 CPIs 的分類

1.1 CPIs 第一類群

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征的不同，已將蛋白性CPIs 拓展為若干個(gè)群。第一群是嚴(yán)格意義上的CPIs 超家族(即Cystatins 超家族)。該群主要分為三個(gè)亞家族:

(1)Stefins(家族Ⅰ)，約10 kDa，是Cystatins 超家族的原型，無二硫鍵及糖基化側(cè)鏈，該抑制劑包括人Stefin A、B，PLCPI(豬白細(xì)胞CPI)以及鼠Stefins α 與β 五種形式［2］。

(2)Cystatins(家族Ⅱ)，約12～14 kDa，在原型基礎(chǔ)上，其C-端衍生出具有兩個(gè)特征性二硫鍵的肽段，N 端有一胞外定位的信號(hào)肽，且通常不具糖基化側(cè)鏈，該抑制劑有雞蛋白cystatin 及Cystatins C、D、E/M、F、G(CRES)、S、SN 和SA 幾種形式［2］。

(3)Kininogens(家族Ⅲ)，約50～120 kDa，其重鏈由三個(gè)重復(fù)的類Cystatin(家族Ⅱ)結(jié)構(gòu)域組成，其中后兩個(gè)域表現(xiàn)出抑制活性，而輕鏈(包括域5及域6)決定了其分子量的大小，重鏈和輕鏈之間由血管舒緩激肽(域4)相連接。除重鏈內(nèi)存在8 個(gè)二硫鍵外，重鏈和輕鏈間還有1 個(gè)鏈間二硫鍵。Kininogens 在生物體內(nèi)通常以糖基化的形式存在。目前已知HMW，LMW 和鼠類T-Kininogen 三種類型［3］。

此外，植物源的Cystatins(Phytocystatins)與動(dòng)物來源的Stefins 和Cystatins(家族Ⅱ)的不同之處僅在于其具有特有的LARFADEHN 共識(shí)序列［4］。因此，Phytocystatins 也被劃分為Cystatins 超家族中一個(gè)獨(dú)特的亞家族。

1.2 CPIs 第二類群

第二群，與第一群的Cystatins 超家族結(jié)構(gòu)相似，但無抑制活性，如胎球蛋白(Fetuins)、富含組氨酸的糖蛋白以及其他Cystatin 相關(guān)蛋白及恒定鏈等［5］。有研究表明，除日本響尾蛇(Japanese Habu snake，Trimeresurus flavoviridis)Fetuin 含有13 個(gè)半胱氨酸殘基外［6］，其他所有的Fetuins 都包含12 個(gè)半胱氨酸殘基。并且已經(jīng)從人類、小鼠、兔子、牛以及豬血漿中純化出富含組氨酸的糖蛋白［7］。

1.3 CPIs 第三類群

第三群為與Cystatins 超家族不具結(jié)構(gòu)同源性的CPIs，主要包括以下七類:

1.3.1 Thyropins 家族

Thyropins 家族，即甲狀腺球蛋白I 型域(Thyr-1 domain)抑制劑家族［8］，是第三群CPIs 中最大的一類。甲狀腺球蛋白I 型域是富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)單元，以單一或重復(fù)序列在多種功能上并不相關(guān)的蛋白中存在。主要包括甲狀腺激素類前體、甲狀腺球蛋白、基膜蛋白、巢蛋白(內(nèi)功素)、睪丸蛋白多糖、睪丸蛋白聚糖、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)，胰腺癌的標(biāo)志蛋白(GA733)，MHC II-結(jié)合的p41 恒定鏈片段［9］、?？?Sea anemone，Actinia equina)抑 制 劑Equistatin［10］、鮭(Chum salmon，Oncorhynchus keta)卵半胱氨酸蛋白酶抑制劑［11］(ECI)和北美牛蛙(North American bullfrog，Rana catesbiana)血漿中的神經(jīng)毒素saxiphilin［12］等。其中，經(jīng)鑒定主要是最后4 種抑制劑對(duì)木瓜蛋白酶家族C1 具有可逆抑制活性。甲狀腺球蛋白及巢蛋白(內(nèi)功素)不具抑制活性，而其他蛋白的抑制活性不清楚或尚未測(cè)試。

1.3.2 類/前體肽家族

類木瓜蛋白酶通常以失活酶原的形式翻譯表達(dá)。其N 端前體肽的有效抑制導(dǎo)致酶原活性缺失。只有在靶位點(diǎn)，前體肽發(fā)生限制性蛋白水解，酶才表現(xiàn)出自身的活性。前體肽是一種競(jìng)爭(zhēng)性慢結(jié)合抑制劑，與廣譜的Cystatins 不同，它對(duì)與其同源的酶具有高度的選擇性［2］。除了作為抑制劑外，前體肽還能幫助同源酶正確的折疊和定位，并穩(wěn)定同源酶。

1.3.3 IAP 家族

細(xì)胞凋亡抑制劑IAPs，是一類家族蛋白，其明顯特征是包含了一個(gè)或多個(gè)含有70 氨基酸殘基以上的鋅結(jié)合BIR 域，且每個(gè)BIR 包括3 個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1 個(gè)保守的組氨酸殘基［13］。IAPs 被初步鑒定為細(xì)胞凋亡抑制因子，能夠直接抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性半胱氨酸蛋白酶caspases 的活性。

與其他抑制劑蛋白不同，BIR 域并非是一個(gè)獨(dú)立的抑制單位。對(duì)于不同的caspases，IAPs 的抑制機(jī)制也不盡相同。因此，IAPs 的分類，是根據(jù)與BIR domain 的結(jié)構(gòu)相似性及其在凋亡路徑中的一般性功能，而并非根據(jù)其抑制機(jī)制。

首次對(duì)IAPs 的報(bào)道，是發(fā)現(xiàn)桿狀病毒中存在細(xì)胞凋亡抑制因子p35 蛋白［14］。目前已知從酵母菌到哺乳動(dòng)物的生物體中均存在IAPs。已經(jīng)鑒定得到8 個(gè)人類IAPs［15］:X 染色體連鎖的IAP(XIAP/ILP-1/MIHA)，c-IAP1 (HIAP-2/MI-HB)，c-IAP2(HIAP-1/MIHC)，神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(NAIP)，生存素(Survivin/TIAP)，Livin(ML-IAP/KIAP)，ILP-2(Ts-IAP)和apollon(Bruce)。其中，前五種IPAs 的過量表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡。

1.3.4 Calpastatin 家族

Calpastatin 是鈣激活中性半胱氨酸蛋白酶calpains 的一類特異的內(nèi)源性抑制劑，并不抑制其他半胱氨酸蛋白酶，且Calpains 的活性也只受Calpastatin調(diào)節(jié)。然而，有學(xué)者研究表明Calpastatin 的磷酸化可以影響其對(duì)某些calpains 的抑制活性［16］。此外，Calpastatin 與其他已知蛋白無序列相似性［5］。且calpastains 的激活可能與某種細(xì)胞凋亡路徑有關(guān)，合成的calpain 抑制劑及注射或過量表達(dá)calpastain時(shí)，能夠使得一些細(xì)胞免于凋亡［17，18］。Calpastatin水平的持續(xù)降低則可以加快凋亡細(xì)胞的死亡速度［18］。

1.3.5 Chagasins 家族

Chagasin (Q966X9)最早是在克氏錐蟲(Trypanozoma cruzi)中發(fā)現(xiàn)的一種CPI，對(duì)來自錐形蟲的半胱氨酸蛋白酶cruzipain 和木瓜蛋白酶，均具有抑制活性。但是Chagasin 具有類免疫球蛋白的全β 折疊結(jié)構(gòu)，因此與Cystatins 超家族及其他已知群都沒有同源性［19］。此后，Chagasin 的同系物在布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、利什曼蟲屬(Leishmania sp)、瘧原蟲屬(Plasmodium sp)以及細(xì)菌(Pseudomonas aeruginosa)的基因組中得到鑒定［20，21］，進(jìn)而形成了Chagasins 家族。

1.3.6 Mycocypins 家族

Clitocypin(P82314)是一種從水粉杯傘(Clitocybe nebularis)子實(shí)體中提取的新型CPI，其氨基酸序列除與從白黃側(cè)耳(Pleurotus Cornucopiae)中分離的一種類凝集素蛋白相似外，與任何已知的CPIs 或其他蛋白都沒有明顯的相似性［22］。因此，提出一個(gè)新的CPI 家族稱為Mycocypins。該蛋白質(zhì)以非共價(jià)形成的二聚體形式和酶以1∶1 比率結(jié)合，從而抑制C1 家族蛋白酶:木瓜蛋白酶、組織蛋白酶L 和B 以及菠蘿蛋白酶。此后，從擔(dān)子菌高大環(huán)柄菇(Parasol mushroom，Macrolepiota procera)中分離出另一種Mycocypins 家族的抑制因子Macrocypins［23］。

1.3.7 Staphostatins 家族

對(duì)葡萄球菌屬微生物半胱氨酸蛋白酶staphospain 具有專一抑制活性的Staphostatins，構(gòu)成了一個(gè)新的抑制因子家族。已經(jīng)鑒定得到該家族的三個(gè)成員，分別是來自金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Staphostatin A 和B，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的Staphostatin A，三者都具有非常嚴(yán)格的專一性［24］。

2 CPIs 的結(jié)構(gòu)及抑制機(jī)制

1988年Bode W 等［25］利用X 射線衍射法對(duì)雞蛋白Cystatin(家族II)和stefin B 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析，表明兩類分子二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，主要由5 個(gè)α-螺旋和5 股反平行的β-折疊片以及1 個(gè)附加不完全的α-螺旋所構(gòu)成，其中β-折疊片包覆、纏繞在α-螺旋的周遭［25］。β1 位于N 端，β2-5 位于C 端。在β 片層的末端，暴露出第1 個(gè)β 發(fā)卡環(huán)(保守序列Q-XV-X-G)，其兩側(cè)分別為N 末端區(qū)域(含有一個(gè)保守的G)和第二個(gè)β 發(fā)卡環(huán)(保守序列P-W)。這3 個(gè)存在活性保守序列的結(jié)構(gòu)域形成1 個(gè)三邊楔形結(jié)構(gòu)，占據(jù)了木瓜蛋白酶的與底物結(jié)合的位點(diǎn)，從而起到了抑制木瓜蛋白酶的作用。

3 CPIs 的生理活性、功能

3.1 CPIs 與腫瘤的關(guān)系

CPIs 能抑制細(xì)胞內(nèi)外的半胱氨酸蛋白酶，在腫瘤的生長(zhǎng)、血管新生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要調(diào)節(jié)作用，可作為腫瘤診斷和預(yù)后估計(jì)的標(biāo)志物。Strojan P 等［26］研究頭頸癌發(fā)現(xiàn)，高濃度Stefin A 可防止手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)。此外，Jin L 等［27］研究表明Cystatin E/M(CST6)可以抑制乳癌細(xì)胞增生，克隆形成，遷移以及侵入。Kininogen 的域5 及其組成肽具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生及血管形成和腫瘤生長(zhǎng)的作用［28］。當(dāng)克隆的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480-ADH 中缺乏內(nèi)源Cystatin D 時(shí)，外源Cystatin D 的表達(dá)既可以抑制體外癌細(xì)胞增殖也可以抑制異種移植腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)。而且，CystatinD 可通過對(duì)抗Wnt/β-catenin 信號(hào)途徑，抑制c-MYC 及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換誘導(dǎo)因子SNAI1，SNAI2，ZEB1，ZEB2 的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的分化增殖。相反地，Cystatin D 誘導(dǎo)了E-cadherin等其他粘附蛋白的表達(dá)從而增強(qiáng)細(xì)胞的粘附性。還能夠抑制癌細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)，因此Cystatin D 被認(rèn)為是一個(gè)抑制癌癥的候選基因［29］。

3.2 CPIs 與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

此外，CPIs 與細(xì)胞凋亡有關(guān)。在不同的細(xì)胞環(huán)境下，Cystatin C 會(huì)參與多種信號(hào)路徑，從而調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)或抑制)細(xì)胞的凋亡，Cystatin C 通過JNK(c-Jun氨基末端激酶抑制劑)-依賴路徑可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［30］。同時(shí)，Kininogen 的域5 可以誘導(dǎo)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMECs)凋亡并干擾細(xì)胞周期［31］，這種抑制也是與培養(yǎng)基質(zhì)成分有關(guān)，而且依賴于細(xì)胞內(nèi)活性氧組分的產(chǎn)生，同時(shí)伴隨了谷胱甘肽和內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物的清除。此外，氧化性應(yīng)激促進(jìn)了培養(yǎng)神經(jīng)元中Cystatin C 的表達(dá)，而Cystatin C 可能對(duì)氧化性應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡起到重要的調(diào)節(jié)作用［32］。而IAPs 則可在人類各種癌細(xì)胞中異常大量表達(dá)，使得癌細(xì)胞逃避凋亡［33］。

3.3 CPIs 與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系

CPIs 與免疫調(diào)節(jié)，關(guān)系密切。Staun-Ram E等［34］研究表明，組織蛋白酶可能在免疫細(xì)胞遷移中起作用，因?yàn)镃ystatin C 可以降低單細(xì)胞和T 細(xì)胞的遷移能力。同時(shí)，組織蛋白酶S 和B 的特異性抑制劑并不影響單細(xì)胞遷移，但可以顯著的抑制T 細(xì)胞遷移。

有研究表明Cystatin C 在抗原呈遞過程中對(duì)恒定鏈Ii 的降解和MHC(主要組織相容性抗原系統(tǒng)major histocompatibility system)的轉(zhuǎn)運(yùn)起了不可忽視的調(diào)控作用［35］。此外，Cystatins 超家族的3 個(gè)家族代表性成員(人Stefin B、雞Cystatin、鼠T-kininogen)均能上調(diào)IFN-γ 活化的MPMs(巨噬細(xì)胞)合成NO，而對(duì)未活化的MPMs 不起作用［36］。并且，CPIs 還能夠通過調(diào)節(jié)TNF-α、IL-10［37］、IL-6、IFN-γ［38］等免疫相關(guān)細(xì)胞因子的水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，參與免疫調(diào)節(jié)［37-39］。

3.4 CPIs 與骨改建調(diào)節(jié)的關(guān)系

CPIs 參與骨改建的調(diào)節(jié)，具有抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成的活性，這對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松具有意義。然而CPIs 對(duì)骨生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，尚不完全清楚。研究證實(shí)分泌型的Cystatin(家族II)［40，41］和胞內(nèi)型的人Stefin B(家族I)［42］均可通過抑制骨陷窩中組織蛋白酶Cathepsin K、L 等對(duì)骨基質(zhì)膠原蛋白的降解，起到保護(hù)骨有機(jī)成分免于過度溶解的作用。同時(shí)，近年來發(fā)現(xiàn)人Cystatin C 和雞蛋白Cystatin 還能夠抑制破骨細(xì)胞的分化和生成，防止骨的過度吸收，但對(duì)成熟的破骨細(xì)胞無作用［43］。

牛HMW-Kininogen(家族III)經(jīng)胃蛋白酶消化后釋放的片段1.2(即Domain5)對(duì)培養(yǎng)16 h［44］或24 h［45］的OB 有促增殖活性，且片段1.2 經(jīng)模擬胃液消化后得到的13 KDa 片段(Fr13)和8 KDa 片段(Fr8)，活性仍然存在，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增殖，并減少成骨細(xì)胞的凋亡，利于骨形成［45］。也有學(xué)者推測(cè)人的Cystatin C 通過BMP2-Runx2-OCN 信號(hào)級(jí)聯(lián)，促進(jìn)ALP 活性和鈣結(jié)節(jié)形成，增強(qiáng)骨質(zhì)礦化［46］。

3.5 CPIs 的抑菌活性

目前，相關(guān)研究表明，某些陸生動(dòng)物及植物來源的Cystatin(家族II)表現(xiàn)了抗菌活性。人類唾液Cystatin C［47］能夠抑制A 鏈球菌群(group Astreptococci)的生長(zhǎng)，人［48］及小鼠［49］來源的Cystatin S 能夠抑制牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的生長(zhǎng);從雞蛋白中提取的Cystatin 在低濃度即可對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產(chǎn)生明顯抑制效果［50］;長(zhǎng)春花中純化的phytocystatin 能夠抑制大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［51］。Nordahl EA［52］等報(bào)道了哺乳動(dòng)物高分子Kininogen 結(jié)構(gòu)域5 的富含組氨酸的小肽(由20 個(gè)氨基酸殘基組成)，能夠有效殺死了革蘭氏陰性腸桿菌、假單胞菌以及革蘭氏陽性的腸球菌。此外Domain 5 中的肽段HKH20(His479-His498)還具有抗真菌活性，能抑制假絲酵母菌屬(Candida)和馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)［53］。

Cystatin 主要作為一種分泌型抑制劑，其抑菌的機(jī)制，一方面可能其通過抑制細(xì)菌本身分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶而發(fā)揮抑菌作用［50］。另一方面Cystatins N 端與半胱氨酸蛋白酶相互作用的保守序列，會(huì)與細(xì)菌微生物膜上的負(fù)電荷相結(jié)合［54］，甚至穿透細(xì)菌細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，抑制胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶［55］，從而起到抗菌作用。Kininogen 的Domain 5 中的肽段HKH20 則能夠與真菌細(xì)胞膜結(jié)合［53］。

4 魚類CPIs 的純化鑒定

迄今為止，關(guān)于魚類半CPIs 的研究報(bào)道較少，許多鑒定工作尚未開展。僅從少數(shù)幾類魚中純化了CPIs，而在其分類和作用機(jī)制方面的研究尚不深入。

4.1 Stefins

從玻璃魚(Glassfish，Liparis tanakai)卵中純化的18 kDa 的CPI，因不具有活性必需的二硫鍵，因此被推測(cè)為Stefin 類(家族I)［56］。

4.2 Cystatins

繼在大麻哈魚(Chum salmon，Oncorhynchus keta)的多個(gè)組織(肝臟、卵巢、睪丸、心臟、紅色肌、白色肌、血清、腎、胃、鰓、皮、腸、盲腸管等)中發(fā)現(xiàn)CPIs 抑制活性［57］后，又從其腦下垂體中純化并鑒定出了分子量14 kDa 的Cystatin(家族II)，由111 個(gè)氨基酸序列組成，在C 端66～75 和89～109 位存在兩個(gè)二硫鍵。其抑制活性位點(diǎn)與雞卵白蛋白Cystatin 一致即Gly(4)，Gln-X-Val-X-Gly(48-52)，Ile(Val)-Pro-Trp(96～98)［58］。

從歐洲金鯽(Golden crucianCarassius auratus)卵中純化出了在還原條件下分子量為11.9 和14.4 kDa，而在非還原條件下分子量為13.5 和12.7kDa的cst-I 和cst-II。cst-I 片段與普通鯽魚Cystatin 氨基酸序列間有88.9%的同源性，而與其他水生動(dòng)物Cystatins 的N 端序列有44.4%～55.6%的同源性，因此推測(cè)其屬于家族II［59］。

臺(tái)灣學(xué)者對(duì)普通鯉魚(Carp，Cyprinus carpio)卵CPI(具有家族II 的部分特征)進(jìn)行的純化、活性及結(jié)構(gòu)鑒定及克隆表達(dá)，其與雞蛋白Cystatin(家族II)、鱘魚、鮭魚以及人的Cystatin C 的同源性較低［60，61］。且容易形成二聚體，可能與其蛋白序列中親水性Met 62 的位置有關(guān)［62］。

此外，從鰱魚(Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix)卵中分離純化的小分子CPIs 組分(10.5 kDa、16.5 kDa 和12 kDa、7kD 和10kd)均可顯著的抑制半胱氨酸組織蛋白酶引起的肌球蛋白的降解［63，64］。

4.3 Kininogens

Kim Y 及Li DK 等2006 及2008年［65，66］陸續(xù)報(bào)道了從大麻哈魚(Chum salmon，Oncorhynchus Keta)的卵及血漿中純化出了72.6 kDa 和70 kDa 的高分子CPIs，并推測(cè)為Kininogen(家族III)。其中，卵中純化的72.6 kDa 的CPI，是由2 條分子量分別為54和18.6 kDa 的多肽鏈組成的異源二聚體，對(duì)木瓜蛋白酶的抑制活性低于70 kDa 抑制劑蛋白。

芬蘭學(xué)者從大西洋鮭魚(Atlantic salmon，Salmo salarL.)［67］、花狼鳚(Spotted wolfish，Anarhichas minor)及大西洋鱈魚(Atlantic cod，Gadus morhua)［68］皮膚中純化的52 kDa、51.0 kDa 和45.8 kDa 的CPI，因其序列中含有魚的bradykinin 結(jié)構(gòu)域，因此將其歸為Kininogens(家族III)。上述三種Kininogens(家族III)都具有脊椎動(dòng)物中常見的唾液酸化的二天線或三天線型的N-糖苷多糖和雙唾液酸化一型核的O-糖苷多糖。此外，不同的糖基化作用也導(dǎo)致CPIs 產(chǎn)生了不同的等電點(diǎn)［68］。

此外，宋川從鰱魚(Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix)卵中純化出了89 kDa 大分子CPI-I，為糖蛋白，且可抑制鰱魚組織蛋白酶L，并具有顯著的熱穩(wěn)性［69］。

4.4 Thyropins

在大麻哈魚(Chum salmon，Oncorhynchus keta)卵中又純化了一種Thyropin 類的9 kDa CPI，其類thyroglobulin 的結(jié)構(gòu)域功能尚不清楚，抑制作用機(jī)制也有待研究［70］。

4.5 類前體肽類

Olonen A［71］等證明在大西洋鮭魚(Atlantic salmon，Salmo salarL)以及紅點(diǎn)鮭(Arctic charr，Salvelinus alpinus)中存在的salarin gene 編碼了一種類似前體肽的CPI，并從大西洋鮭(Atlantic salmon，Salmo salarL)魚皮中分離得到了分子量43 kDa，pI 5.1 的一種新型的類似前體肽的CP，即salarin，其可以抑制木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶，但不抑制胰蛋白酶［67］。

4.6 Calpastatin

除了從虹鱒魚(Rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)［72］中克隆表達(dá)出兩種Calpastatins 外，還有學(xué)者［73］從大西洋鮭(Atlantic salmon，Salmo salarL.)魚肉中純化出兩種Calpastatins，而在哺乳動(dòng)物只發(fā)現(xiàn)了一種Calpastatin，這些都暗示了魚肉Calpastatin 與哺乳動(dòng)物不同。與哺乳動(dòng)物Calpastatins相比，魚類Calpastatins 具有更少的重復(fù)抑制區(qū)域［72］Calpastatins 表達(dá)與抑制活性與魚肉片品質(zhì)之間存在潛在關(guān)聯(lián)［74］。

4.7 其他新類別

日本學(xué)者依次從日本鰻魚(Anguilla japonica)皮膚粘液中純化的Eel-CPI-1［75］以及Eel-CPI-2、Eel-CPI-3［76］，僅能抑制木瓜蛋白酶對(duì)蛋白大分子底物的水解。該類CPI 可能與木瓜蛋白酶以非共價(jià)鍵方式結(jié)合，其氨基酸組成和分子量及N 端封閉的結(jié)構(gòu)特征都分別與日本鰻魚皮膚粘液中的凝集素AJL2以及AJL1 很相似，因此，推測(cè)可能是一類新蛋白酶抑制劑，但尚需要進(jìn)一步證實(shí)。

總之，有關(guān)魚類CPIs 的分子結(jié)構(gòu)、種類組成、生理活性等有待進(jìn)一步研究。

5 魚類CPIs 的活性及功能

魚類由于其進(jìn)化地位和生活環(huán)境的特殊性，其CPIs 可能在結(jié)構(gòu)和功能方面，與哺乳動(dòng)物有所差異，甚至存在某種特殊的活性或作用機(jī)制。然而目前對(duì)魚類CPIs 功能了解甚微，相關(guān)報(bào)道也寥寥無幾。

5.1 CPIs 在發(fā)育保護(hù)方面的作用

鱸魚孵化后7 d 的卵中Cathepsin L 活性越高，孵化率越低［77］。Li F 等［78］研究表明在虹 鱒魚(Rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)胚胎組織中Cystatin C(家族II)的mRNA 表達(dá)豐富，可能對(duì)發(fā)育中的胚胎有保護(hù)作用。另外，近年來有學(xué)者研究證明鯉魚卵Cystatin 能夠通過凝集精子防止鯉魚卵多精受精，并且其抑制能力受鹽濃度和pH 的影響很大［79］。

5.2 CPIs 在免疫調(diào)節(jié)方面的作用

Li S 等［80］研究發(fā)現(xiàn)克隆表達(dá)的大黃魚(Large yellow，CroakerLarimichthys crocea)Cystatin(家族II)類似物，注射后能夠刺激大黃魚脾和腎中免疫相關(guān)基因TNF-α 和IL-10 mRNA 水平的上調(diào)。另外，其研究還表明，在三聯(lián)滅活細(xì)菌疫苗或poly(I:C)作為刺激物進(jìn)行誘導(dǎo)后，Lycstefin 基因在大黃魚腎和脾中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有不同程度的上調(diào)，在血液中則有不同程度的下調(diào)，同時(shí)還表明Lycstefin 參與細(xì)菌或病毒引起的免疫應(yīng)答，對(duì)細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)在較晚時(shí)間作出應(yīng)答［81］。此外，大菱鲆(Turbot，Scophthalmus maximus)的Stefin B(家族I)參與了抗細(xì)菌感染的免疫機(jī)制，其基因SmCytB 在頭腎巨噬細(xì)胞中瞬間過量表達(dá)，提高了巨噬細(xì)胞的抗菌活性［82］。

魚皮膚本身就是魚對(duì)病原體的一個(gè)防御屏障，而魚皮膚及其粘液中存在多種類型CPIs［75，76］，尤其具有保護(hù)型多糖結(jié)構(gòu)的Kininogen［83］，都可能說明它們通過某種尚不明確的途徑起到防御媒介的作用，參與魚類先天免疫。

5.3 CPIs 在抑制腫瘤中的作用

虹鱒 魚(Rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)Cystatin C 的mRNA 在其黃曲霉毒素誘導(dǎo)的肝腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于與正常肝細(xì)胞，說明Cystatin C 可能與魚類的腫瘤發(fā)生之間具有某種潛在調(diào)節(jié)關(guān)系。作者所在團(tuán)隊(duì)前期從鰱魚(Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix)卵中分離的CPIs 在體外抑制了子宮內(nèi)膜癌(Ishikawa)細(xì)胞的增殖，使其遷移及粘附能力顯著下降［84］。

5.4 CPIs 在調(diào)節(jié)骨生長(zhǎng)方面的作用

目前，除本實(shí)驗(yàn)室對(duì)鰱魚Cystatin 在成骨細(xì)胞增殖分化方面進(jìn)行了探索研究外，尚未見魚源CPIs的相關(guān)報(bào)道。作者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，鰱魚Cystatin 能夠促進(jìn)小鼠MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨形成［85］。

5.5 CPIs 在抑菌方面的作用

目前，除本實(shí)驗(yàn)室對(duì)鰱魚Cystatin 的抑菌活性進(jìn)行了相關(guān)研究外，尚未見魚源CPIs 抑菌活性的研究報(bào)道。作者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，鰱魚Cystatin對(duì)銅綠假單胞菌［86］及冷藏魚肉片中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌熒光假單胞菌［87］，具有顯著的抑制效果，推測(cè)其可能在水產(chǎn)原料及其冷藏制品貯藏過程中，發(fā)揮良好的防腐保鮮作用。

6 展望

蛋白性CPIs 在動(dòng)植物界廣泛存在，且種類較多。目前對(duì)陸生動(dòng)物研究較透徹。而魚類CPIs 研究較少，但其很可能存在某些不同與陸生動(dòng)物的特殊的活性或作用機(jī)制。然而近年來對(duì)于魚類CPIs的探索性應(yīng)用研究，僅局限于抑制魚糜凝膠或魚肉質(zhì)軟化，如大馬哈魚卵cystatin 可以有效抑制狹鱈魚糜的凝膠軟化。添加純化的鰱魚卵小分子CPIs 均可顯著的提高鰱魚魚糜的凝膠強(qiáng)度，尚未將其作為一種生物活性成分進(jìn)行系統(tǒng)的研究、開發(fā)利用。同時(shí)，已知蛋白性CPIs 具有癌癥抑制、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)骨生長(zhǎng)以及刺激細(xì)胞凋亡等多種生理活性功能及顯著的抑菌活性。因此，對(duì)魚類CPIs 進(jìn)行分離純化鑒定，并進(jìn)一步探究其各種活性及功能具有重要的意義。同時(shí)，利用其抑菌、抑制腫瘤等功能作用，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，必定具有廣闊的前景。

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