黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS的多樣性

繆福俊，蔣 宏，王宏虬，原曉龍，陳 劍，楊宇明，王 娟

（1.云南省林業(yè)科學(xué)院 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650201；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明650224）

黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS的多樣性

繆?？?，蔣 宏1，王宏虬2，原曉龍1，陳 劍1，楊宇明1，王 娟1

（1.云南省林業(yè)科學(xué)院 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650201；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明650224）

杓蘭屬Cypripedium植物因具較高的觀賞和藥用價(jià)值而長期被過度采集，已成為瀕危植物。菌根真菌是其栽培和保育能否成功的重要協(xié)同因子。采用免培養(yǎng)技術(shù)對滇西北4個(gè)不同居群的黃花杓蘭Cypripedium flavum毛根的真菌進(jìn)行核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS）區(qū)段擴(kuò)增。結(jié)果表明：從4個(gè)居群的毛根中共克隆得到366個(gè)真菌ITS-taxa，其中白水河居群93個(gè)，石卡雪山居群90個(gè)，天生橋居群103個(gè)，納帕村居群80個(gè)；黃花杓蘭毛根系統(tǒng)中存在豐富多樣的菌根真菌類型，分別涉及膠膜菌屬Tulasnella，伏革菌屬Corticium，瘤菌根菌屬Epulorhiza和絲核菌屬Rhizoctoia 4個(gè)屬及一類歸屬未定的真菌（uncultured mycorrhizal fungi）；膠膜菌屬對于黃花杓蘭具有一定的寄主專一性特征，可能對黃花杓蘭的生長有促生作用。以上結(jié)果為菌肥的研制和黃花杓蘭植物的栽培與保育工作提供科學(xué)依據(jù)。圖1表3參24

微生物學(xué)；黃花杓蘭；菌根真菌；rDNA ITS；膠膜菌屬；多樣性

Key words:microbiology;Cypripedium flavum;mycorrhizal fungi;rDNA ITS;Tulasnella；diversity

黃花杓蘭Cypripedium flavum屬蘭科Orchidaceae杓蘭屬Cypripedium植物，為中國特有種，分布于云南西北部、西藏東南部、四川、甘肅南部和湖北西部的高海拔地區(qū)，是一種典型的多年生高山草本植物［1］。因其花型獨(dú)特、色彩艷麗，是整個(gè)蘭科植物中最具特色的類群之一，極具觀賞價(jià)值。然而，人類對杓蘭野生環(huán)境的日益破壞，使得黃花杓蘭種群數(shù)量急劇下降。該種已處于瀕危狀態(tài)，亟待保護(hù)［2－3］。目前，在杓蘭屬植物保育工作中，因多數(shù)自花不育導(dǎo)致自然結(jié)實(shí)率較低，種子微小，多采取分株繁殖和組織培養(yǎng)方式進(jìn)行擴(kuò)繁種苗［4－5］。在此過程中存在一個(gè)很大的瓶頸：在擴(kuò)繁種苗過程中，杓蘭幼苗出現(xiàn)生長緩慢、死亡率高等常見問題，極大地限制了瀕危植物杓蘭的保育工作［6－7］。前人的研究表明：蘭科植物對菌根真菌具有較高的依賴性，菌根可能成為杓蘭營養(yǎng)代謝的重要協(xié)同因子［8］。在自然條件下，蘭屬植物必須與真菌建立共生關(guān)系，其種子萌發(fā)、幼苗生長發(fā)育以及成年蘭屬植物營養(yǎng)的獲取才得以實(shí)現(xiàn)［9］。Harley等［8］于1983年首次證實(shí)杓蘭和真菌是互利的關(guān)系。同時(shí)Hadley等［10］也認(rèn)為：平衡的共生關(guān)系可在一定條件下變?yōu)榧纳P(guān)系，接種根際促生菌可顯著提高杓蘭幼苗的成活率。Shimura等［11］的研究表明：兩者可能是斗爭的關(guān)系，但通過前期的斗爭，一旦真菌與杓蘭建立共生關(guān)系后，可互利共生。王瑞苓等［12］通過對黃花杓蘭植株根的生長周期切片觀察，也證實(shí)菌根真菌與黃花杓蘭是互惠互利的共生關(guān)系。臧穆等［13］在黃花杓蘭的根際和根皮層細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不同階段的小型菌核，菌核的存在表明：杓蘭和真菌是協(xié)同的關(guān)系。侯天文等［14］研究發(fā)現(xiàn)：四川黃龍溝杓蘭的菌根真菌多樣性隨生長季節(jié)轉(zhuǎn)換呈現(xiàn)的變化規(guī)律與營養(yǎng)需求規(guī)律是基本一致的。高倩等［15］對黃花杓蘭，云南杓蘭Cypripedium yunnanense,西藏杓蘭Cypripedium tibeticum和斑花杓蘭Cypripedium guttatum的菌根結(jié)構(gòu)及其周年動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)真菌的新近入侵、開始被消解、消解后的殘余及消解后的物質(zhì)4個(gè)階段在這4種杓蘭的生活周期中周而復(fù)始地進(jìn)行。上述前人的研究主要集中于菌根解剖結(jié)構(gòu)特征觀察和真菌的入侵方式等方面，有關(guān)杓蘭屬植物菌根真菌多樣性的研究還缺乏報(bào)道。本研究前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃花杓蘭在滇西北高海拔區(qū)域分布較多，這為研究杓蘭屬植物菌根真菌提供極好的試驗(yàn)材料。本研究以黃花杓蘭毛根為材料，提取總DNA，采用免培養(yǎng)巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增其真菌核糖體脫氧核糖核酸內(nèi)轉(zhuǎn)錄隔離區(qū)（rDNA ITS）區(qū)段，并對不同居群黃花杓蘭的菌根真菌多樣性進(jìn)行分析，為杓蘭屬植物的保育和開發(fā)利用方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采樣地的地理位置信息詳見表1。采集時(shí)間為杓蘭花盛開期（2013年6月10日）。黃花杓蘭為地生蘭，生于林緣，樣地為腐殖質(zhì)土壤。根據(jù)采樣地點(diǎn)分為4個(gè)不同的居群，對每種選樣植株（居群）中隨機(jī)選取5株進(jìn)行取樣，在黃花杓蘭的根尖處選取毛根段10個(gè)·株－1，長約1 cm。用水洗凈根尖土壤，置于裝有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）緩沖液的1.5 mL離心管中，避光低溫儲(chǔ)存。

表1 滇西北黃花杓蘭采樣居群表Table 1 Sample collection of Cypripedium flavum at Northwest of Yunnan

1.2 方法

1.2.1 樣品總DNA的提取 采用天根DNA試劑盒提取各樣品中的總DNA。

1.2.2 樣品rDNA ITS區(qū)段擴(kuò)增和多樣性分析 采用Nest PCR方法擴(kuò)增，第1輪PCR擴(kuò)增引物為NSI1和NLB4（NSI1：5′-GATTGAATGGCTTAGTGAG-3′，NLB4：5′-GGATTCTCACCCTCTATGA-3′）。反應(yīng)體系為：1.0 μL模板DNA，1.0 μL NSI1，1.0 μL NLB4，9.5 μL雙蒸水（ddH2O），12.5 μL Prime STAR Max DNA Premix（2×）。反應(yīng)條件為：98℃30 s，60℃5 s，72℃10 s，30次循環(huán)，72℃1 min。

第2輪PCR擴(kuò)增引物為NSI1-F和ITS4（NSI1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應(yīng)體系為：1.0 μL第1輪Nest PCR產(chǎn)物做模板DNA，1.0 μL NSI1-F，1.0 μL ITS4，9.5 μL ddH2O，12.5 μL Prime STAR Max DNA Premix（2×）。反應(yīng)條件為：98℃10 s，55℃5 s，72℃10 s，30次循環(huán)，72℃1 min。

將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶Hinf1和Alu1進(jìn)行酶切分析。反應(yīng)體系為：3.0 μL PCR產(chǎn)物，1.0 μL內(nèi)切酶緩沖液（10×），1.0 μL內(nèi)切酶，5.0 μL雙蒸水。37℃水浴4 h。經(jīng)電泳檢測，分析限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）帶型。將代表不同的RFLP帶型的單克隆樣品挑出，連接載體pEASYBlunt轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，用菌液PCR法（M13F、M13R引物）鑒定重組子，確認(rèn)包含重組子的克隆，送上海生工公司用M13F和M13R引物測序。測序結(jié)果用DNAman去除載體后使用在線軟件NCBI Blast進(jìn)行比對分析。

1.2.3 多樣性指數(shù)計(jì)算 集中性測度：λ=Σ［Ni（Ni-1）/N（N-1）］；多樣性測度：D=1-Σ ［Ni（Ni-1）/N（N-1）］，公式中N為樣方中物種總體個(gè)數(shù)，Ni為第i種個(gè)體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花杓蘭毛根中真菌rDNA ITS區(qū)段聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增結(jié)果

黃花杓蘭部分毛根總DNA的提取電泳結(jié)果如圖1A所示，其真菌rDNA ITS區(qū)段擴(kuò)增結(jié)果如圖1B所示，表明提取的總DNA條帶清晰，采用巢式PCR可較好地?cái)U(kuò)增得到rDNA ITS區(qū)段，大小均在750 bp左右。

圖1 黃花杓蘭毛根中真菌rDNA ITS PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of rDNA ITS PCR amplification products of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum

2.2 黃花杓蘭毛根中真菌ITS序列分析結(jié)果

從4個(gè)不同居群黃花杓蘭的毛根中直接提取的總DNA，通過Nest PCR擴(kuò)增及克隆建立了4個(gè)克隆庫，總共得到了366個(gè)單克隆，其中從白水河居群中得到93個(gè)單克隆，從石卡雪山居群中得到90個(gè)單克隆，從天生橋居群中得到103個(gè)單克隆，從納帕村居群中得到80個(gè)單克隆。

2.3 不同居群黃花杓蘭ITS序列多樣性分析

從表2可見：白水河居群涉及3個(gè)真菌屬，分別屬于瘤菌根菌屬Epulorhiza，歸屬未定真菌（Uncultured mycorrhizal fungi）和膠膜菌屬Tulasnella，均屬典型的蘭科菌根真菌類型。其中，瘤菌根菌屬占大多數(shù)，頻率為58.1%，同源性為97%，其次是膠膜菌屬，與美胞膠膜菌Tulasnella calospora的同源性高達(dá)98%，可初步確定為美胞膠膜菌。集中性指數(shù)λ=0.489，多樣性測度D=0.511；石卡雪山居群涉及3個(gè)真菌屬，分別屬于膠膜菌屬、絲核菌屬Rhizoctoia和瘤菌根菌屬。其中，膠膜菌屬占大多數(shù)，頻率為41.1%，同源性為98%，其次是絲核菌屬。集中性指數(shù)λ=0.350，多樣性測度D=0.650；天生橋居群涉及3個(gè)真菌屬，分別屬于膠膜菌屬，伏革菌屬Corticium和瘤菌根菌屬。膠膜菌屬占大多數(shù)，頻率為69.9%，同源性為97%，其次是伏革菌屬。集中性指數(shù)λ=0.568，多樣性測度D=0.432；納帕村居群涉及1個(gè)真菌屬，全部屬于膠膜菌屬，與美胞膠膜菌的同源性高達(dá)99%。集中性指數(shù)λ=0.640，多樣性測度D=0.360。

表2 黃花杓蘭菌根真菌rDNA ITS序列的Blast比對結(jié)果Table 2 Blast results of rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum

2.4 不同居群黃花杓蘭菌根真菌類型

從表3可見：4個(gè)居群的黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中涉及4個(gè)真菌屬，其中膠膜菌屬、瘤根菌屬和伏革菌屬隸屬于擔(dān)子菌亞門Basdiomycotina，絲核菌屬隸屬于半知菌亞門Deuteromycotina，還有一類歸屬未定的真菌，所占頻率最少，為1.0%。說明不同居群的黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中可能存在豐度不同的真菌菌落結(jié)構(gòu)，如白水河居群真菌群落豐富多樣，涉及3個(gè)真菌屬，但在納帕村黃花杓蘭居群只有膠膜菌屬，其多樣性較為單一。膠膜菌屬在每一個(gè)居群中都出現(xiàn)且占有較大的比例，高達(dá)61.2%。

表3 黃花杓蘭菌根不同屬真菌的比例Table 3 Number ratio from different genus of mycorrhizal fungi from C.flavum

3 結(jié)論與討論

本研究首次采用微生物免培養(yǎng)技術(shù)對滇西北4個(gè)不同居群的黃花杓蘭植物的毛根總DNA進(jìn)行提取，用真菌ITS區(qū)2對引物NSI1/NLB4和NSI1-F/ITS4直接擴(kuò)增毛根中真菌的ITS區(qū)段，免去了微生物純培養(yǎng)的過程。從4個(gè)不同居群的黃花杓蘭毛根中總共克隆得到366個(gè)真菌ITS-taxa，與NCBI數(shù)據(jù)中的菌根真菌進(jìn)行比對，表明均屬菌根真菌類型。說明黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中存在豐富多樣的真菌類型，此方法能較好地反應(yīng)黃花杓蘭菌根中真菌多樣性水平，能快速的獲得菌根真菌生態(tài)系統(tǒng)中的真菌群落類型。

目前研究已知，感染蘭科植物根部并能與之共生的真菌類型約有擔(dān)子菌亞門的7個(gè)屬（瘤菌根菌屬，膠膜菌屬，臘殼菌屬Sebacina，念珠菌根菌屬M(fèi)oniliopsis，角擔(dān)菌屬Ceratobasidium，層孔菌屬Fomes和伏革菌屬）；半知菌亞門的1個(gè)屬（絲核菌屬）和子囊菌亞門的1個(gè)屬（毛殼菌屬Chaetomium）［16-18］。而本研究發(fā)現(xiàn)：4個(gè)居群黃花杓蘭菌根真菌類型（膠膜菌屬、瘤菌根菌屬、絲核菌屬和伏革菌屬）為典型的蘭科植物菌根真菌，均在蘭科植物菌根真菌系統(tǒng)中已報(bào)道。其中，膠膜菌屬在每一個(gè)居群中都占有較大的比例，且在每個(gè)居群中都出現(xiàn)，說明膠膜菌屬可能是黃花杓蘭菌根真菌系統(tǒng)中的優(yōu)勢種群，存在著一定的寄主特異性。這與已有的研究結(jié)果一致。對膠膜菌屬的美孢膠膜菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌能促進(jìn)蘭科植物（石斛Dendrobium candidum和地寶蘭Geodorum eulophioides）的種子萌發(fā)，可能對蘭科植物的定植和生長有促進(jìn)作用［19］。在本研究的另外3個(gè)居群中都涉及到瘤菌根菌屬真菌，所占比例僅次于膠膜菌屬，說明有瘤菌根菌屬對黃花杓蘭也有著一定的寄主特異性。相關(guān)研究也表明，分離自蘭科植物的瘤根菌屬和膠膜菌屬真菌共同促進(jìn)蘭科植物的生長發(fā)育［20－21］。Oliveira等［22］對巴西4種蘭花不同居群的菌根真菌進(jìn)進(jìn)行菌群多樣性研究發(fā)現(xiàn)，其根內(nèi)生真菌主要為臘殼菌屬，高達(dá)81.61%，對這4種蘭花有著寄主專一性。另外，在3個(gè)居群的黃花杓蘭菌根系統(tǒng)中涉及3種類型的真菌，說明不同種的真菌能促進(jìn)同一種杓蘭植物生長發(fā)育。這很可能是因?yàn)檫@些真菌皆能提供蘭科植物萌發(fā)生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，它們之間存在營養(yǎng)專一性［23－24］，此結(jié)論還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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The rDNA ITS diversity of mycorrhizal fungi with Cypripedium flavum

MIAO Fujun1,JIANG Hong1,WANG Hongqiu2,YUAN Xiaolong1,CHEN Jian1,YANG Yuming1,WANG Juan1
（1.Key Laboratory for Conservation of Rare,Endangered&Endemic Forest Plants,State Forestry Administration, Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201,Yunnan,China;2.School of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan, China）

Cypripedium plants,which are endangered by over-harvesting due to their high ornamental and medicinal value,use mycorrhizal fungi to guarantee cultivation and conservation.In order to explore the diversity of mycorrhizal fungi,the rDNA internal transcribed spacer（ITS）sequences from mycorrhizal fungi of four C.flavum populations（Baishui River,Shika Snow Mountain,Tiansheng Bridge,and Napa Village）were amplified by nested polymerase chain reaction（PCR）methods.Results showed a total of 336 distinct ITS-taxa of C. flavum obtained from clones of mycorrhizal fungi with populations from Baishui River（93）,Shika Snow Mountain （90）,Tiansheng Bridge （103）,and Napa Village （80）.Blast results of rDNA ITS sequences showed a rich diversity in mycorrhizal fungi systems with mycorrhizae belonging to Tulasnella,Corticium,Epulorhiza,and Rhizoctoia.Tulasnella fungi probably had host-specificity and growth-promoting effects on C.flavum.These results may provide a scientific basis for further conservation work of C.flavum and fungal manure development.［Ch,1 fig.3 tab.24 ref.］

S718.81；Q948.12

A

2095-0756（2015）07-0815-06

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云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目（2014FD070）；國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201204110）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2013FA054）；云南省社會(huì)事業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2010CA010）；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2010CI016）；云南藏區(qū)典型區(qū)域生態(tài)安全防控技術(shù)研究及應(yīng)用示范項(xiàng)目；云南省教委濕地生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

繆?？?，研究實(shí)習(xí)員，從事根際微生物研究。E-mail：miaofujun@yeah.net。通信作者：王娟，教授，從事植物分子生物學(xué)與植物菌根研究。E-mail：schima@163.com