酵母DV10發(fā)酵低醇度椰子水的動(dòng)力學(xué)研究

張觀飛 陳衛(wèi)軍 陳文學(xué) 陳榮豪 陳樸森 陳海明

摘 要 用酵母DV10發(fā)酵成熟椰子水并研究發(fā)酵過程中菌體濃度、底物濃度和產(chǎn)物濃度等變量隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律。應(yīng)用Logistic方程和Leudeking-Piret方程建立了低醇度椰子水發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型，并對(duì)動(dòng)力學(xué)擬合方程一階求導(dǎo)，求出其發(fā)酵過程中菌種增長(zhǎng)速率、酒精生成速率和底物消耗速率。方差分析結(jié)果表明：3個(gè)模型的擬合度分別為0.994、0.997、0.997，理論值和實(shí)驗(yàn)值的誤差平均值分別為4.75%、4.36%和4.42%。因此，3個(gè)模型均可很好地闡明酵母DV10發(fā)酵低醇度椰子水過程的動(dòng)態(tài)變化。

關(guān)鍵詞 低醇度椰子水；發(fā)酵；動(dòng)力學(xué)模型；非線性擬合；發(fā)酵速率

中圖分類號(hào) S667.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Fermentation Kinetics of Low Alcoholic Coconut Water

ZHANG Guanfei， CHEN Weijun， CHEN Wenxue， CHEN Ronghao，

CHEN Pusen， CHEN Haiming*

College of Food Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract In this paper， coconut water was fermented by the yeast strain DV10 to study the changing law between concentrations of cell， substrate and production and fermentation time. The kinetic models of yeast growth， alcohol production and sugar consumption were established on the basis of Logistic and Leudeking-Piret equations， and the rates of them were calculated by solving the first derivative of their corresponding equations. According to the results of variance analysis， the fitting degree between the predictive value of kinetic models and experimental data were high（0.994， 0.997， and 0.997， respectively）， and average errors were less than 5%（4.75%， 4.36%， and 4.42%， respectively）， indicating that these models can clarify the dynamic changes of fermentation processes well.

Key words Low alcoholic coconut water； fermentation； kinetic model； non-linear fitting； fermentation rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.026

椰子水（Coconut water，CW）是存在于椰子果實(shí)腔內(nèi)的一種天然果汁，富含糖類、氨基酸、維他命和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，口感清涼，具有解渴降暑、消腫利尿、調(diào)節(jié)體內(nèi)電介質(zhì)平衡等多種功效，深受消費(fèi)者的喜愛[1-5]。然而，椰子加工主要以椰肉為原料，作為副產(chǎn)物的椰子水常被當(dāng)作廢棄物丟棄，不僅造成了大量的資源浪費(fèi)，還嚴(yán)重污染了環(huán)境，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)椰子加工業(yè)每年可產(chǎn)生副產(chǎn)物椰子水近8億升，泰國(guó)每年高達(dá)20萬噸的椰子水被浪費(fèi)，全球范圍內(nèi)，每年產(chǎn)生的椰子水副產(chǎn)物高達(dá)250億升[6-9]。且隨著椰子肉需求量逐漸增大，尤其是椰子汁產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，椰子水的浪費(fèi)量也在逐年遞增。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)代謝與各環(huán)境因子之間的相互作用，并隨時(shí)間變化規(guī)律的一門學(xué)科。微生物發(fā)酵是由多種物質(zhì)參與的復(fù)雜代謝過程的綜合作用結(jié)果，微生物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程必須由數(shù)學(xué)模擬得到。目前，經(jīng)過微生物生理學(xué)家和生化工程學(xué)家的大量模擬試驗(yàn)和反復(fù)的驗(yàn)證修正，提出了許多數(shù)學(xué)模型。根據(jù)培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度在特定環(huán)境條件下的最大值，常用Logistic方程[10]描述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)；根據(jù)酵母的酒精生成與自身生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型關(guān)系，常選擇Luedeking-Piret方程[11]描述酒精生成動(dòng)力學(xué)；根據(jù)底物消耗速率主要取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率、酒精生成速率和底物維持能耗的速率，常選擇Luedeking-Piret方程描述底物消耗動(dòng)力學(xué)。

發(fā)酵飲料是近年來的研究熱點(diǎn)，具有降低膽固醇、抑菌和抗癌等功效[12-15]，通過發(fā)酵的方式改善椰子水品質(zhì)也是拓寬椰子水應(yīng)用范圍的一個(gè)途徑。發(fā)酵過程中的動(dòng)力學(xué)研究可以直觀反映菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物生成的動(dòng)態(tài)變化過程，且酵母發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)研究方法成熟、體系完整。因此，本文選用發(fā)酵能力較強(qiáng)的釀酒酵母DV10對(duì)成熟的椰子水進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上應(yīng)用Logistic方程和Leudeking-Piret方程建立了低醇度椰子水發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型，旨在為優(yōu)質(zhì)低醇度椰子水飲料研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 活性干酵母 釀酒酵母DV10購(gòu)自拉曼公司。使用前用5%蔗糖水在42 ℃活化30 min。

1.1.2 椰子水 成熟椰子取自海南泰豐源公司。

1.1.3 試劑 葡萄糖，蒽酮，偏重亞硫酸氫鈉均為分析純。

1.1.4 儀器 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析TU1810，中國(guó)），超高速離心機(jī)（賽默飛世爾 Fresco 17，美國(guó)），手持折光儀（愛拓 PAL-1，日本），pH計(jì)（梅特勒-托利多FE20，中國(guó)），酒精計(jì)（京都電子DA-130N，日本）。

1.2 方法

1.2.1 低醇度椰子水飲料發(fā)酵工藝流程 選取新鮮的椰子破殼后短時(shí)間內(nèi)取出椰子水（測(cè)得其糖度為4.4 °Brix，pH值為5.53），用濾布和硅藻土分別過濾得到澄清的椰子水。用蔗糖調(diào)節(jié)糖度至約10 °Brix，在90 ℃水浴殺菌10 min，冷卻后添加0.02%偏重亞硫酸氫鈉，分別取2 L椰子水裝入已滅菌的3個(gè)3 L的發(fā)酵罐中。按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量將活化的酵母接種到發(fā)酵液中。接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止發(fā)酵，每隔24 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中的細(xì)胞干重、酒精度和總糖含量。

1.2.2 椰子水減重 采用干重法測(cè)定，具體方法為：取發(fā)酵液置入離心管，12 000 r/min離心10 min，移去上清液，用無菌水清洗，離心；重復(fù)3次；干燥，稱重。

1.2.3 酒精度的測(cè)定 采用蒸餾法測(cè)定，即將發(fā)酵液蒸餾后用酒精計(jì)測(cè)定酒精度。

1.2.4 殘?zhí)橇康臏y(cè)定 蒽酮比色法[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

所有結(jié)果均使用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用Origin 8.0 Pro對(duì)菌體生長(zhǎng)、酒精生成和底物消耗動(dòng)力學(xué)模型方程進(jìn)行非線性回歸模擬和動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的求解并繪圖。

2 結(jié)果與分析

在微生物的培養(yǎng)或發(fā)酵過程中，底物的消耗和產(chǎn)物的生成受到微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)及代謝途徑的制約。底物經(jīng)微生物發(fā)酵主要去向包括：一是用于維持細(xì)胞正常的生命活動(dòng)，二是通過代謝途徑最終轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，三是用于細(xì)胞增值。因此，要進(jìn)行發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型研究，應(yīng)對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)量、代謝產(chǎn)物生成和底物消耗3個(gè)狀態(tài)變量進(jìn)行數(shù)學(xué)描述[17]。

2.1 椰子水發(fā)酵過程中物質(zhì)的變化

椰子水發(fā)酵過程菌體量、酒精產(chǎn)量和殘?zhí)橇侩S發(fā)酵時(shí)間的變化如圖1所示。發(fā)酵1～3 d時(shí)間內(nèi)，酵母DV10的菌體量和酒精產(chǎn)量迅速增加，底物被快速消耗，說明酵母DV10能進(jìn)入增殖階段迅速，發(fā)酵滯后期不明顯，適應(yīng)環(huán)境能力較強(qiáng)。發(fā)酵時(shí)間第4天之后，酒精產(chǎn)量和椰子水消耗量幾乎保持不變，菌體增加不明顯，殘?zhí)橇肯陆邓俣茸兙?，發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期。經(jīng)過10 d發(fā)酵，菌體量為3.1 g/L，酒精產(chǎn)量為5.2% vol，殘?zhí)橇繛?.69 g/L。

2.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型建立

2.2.1 菌種生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 椰子水發(fā)酵過程中酵母生長(zhǎng)曲線是典型的“S”形方程，因此可利用Logistic方程描述菌體生長(zhǎng)的變化規(guī)律，該方程能夠較好地反映發(fā)酵過程中由于細(xì)胞濃度增加對(duì)其自身生長(zhǎng)繁殖所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)[18]。即

式（2）中，xt為酵母菌濃度，g/L；μm為酵母最大的比生長(zhǎng)速，h-1；t為發(fā)酵時(shí)間，h；xm為最大的酵母菌濃度，g/L。

用Origin Pro 8.0對(duì)發(fā)酵過程中的菌體量和發(fā)酵時(shí)間擬合，可得菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)見表1。

將發(fā)酵時(shí)間t代入式（2）可得到酵母DV10菌種生長(zhǎng)擬合方程：

xt=3.02/[1+exp（3.46-1.91t）] （3）

如圖2所示，酵母DV10接種后稍有延遲，即進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段，第4天進(jìn)入穩(wěn)定期，至第10天發(fā)酵結(jié)束酵母菌體量基本維持不變。相關(guān)系數(shù)R2=0.994，說明擬合度好。

2.2.2 酒精生成動(dòng)力學(xué)模型 酒精產(chǎn)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，根據(jù)產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系，酒精生成與菌體自身生長(zhǎng)并非完全同步，而是有一定的滯后性，因此符合部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，選擇Luedeking-Piret方程進(jìn)行描述[19]。即

如圖3所示，酵母DV10接種后即進(jìn)入酒精產(chǎn)量快速增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期階段。進(jìn)入穩(wěn)定期后，酒精含量幾乎保持不變并維持至發(fā)酵結(jié)束。實(shí)測(cè)值與擬合值各點(diǎn)較為接近，相關(guān)系數(shù)R2=0.997，說明擬合度好。

椰子水發(fā)酵過程中的酒精生成主要由菌種數(shù)量、底物含量以及體系中酒精的濃度決定。只有在底物充足且酵母達(dá)到一定數(shù)量之后，酒精的產(chǎn)量才能快速提高，但是當(dāng)酒精濃度達(dá)到一定值后，酵母產(chǎn)酒精的活性則會(huì)受到抑制而使得發(fā)酵液中酒精的濃度穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。

2.2.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型 發(fā)酵殘?zhí)橇康膶?shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。在發(fā)酵過程中，碳源和能源主要用于：（a）形成細(xì)胞物質(zhì)即酵母生長(zhǎng)，（b）產(chǎn)生供細(xì)胞維持生命的能量即維持酵母代謝，（c）生成產(chǎn)物如酒精和一些副產(chǎn)物。因此，底物消耗速率主要取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率、酒精生成速率和底物維持能耗的速率。底物消耗動(dòng)力學(xué)模型的表達(dá)式根據(jù)Luedeking-Piret方程可以推導(dǎo)為：

如圖4所示，酵母DV10接種后，殘?zhí)橇块_始下降，對(duì)數(shù)期幾乎保持勻速快速下降狀態(tài)，穩(wěn)定期糖降解速度緩慢；實(shí)測(cè)值與擬合值各點(diǎn)均較為接近。酵母DV10相關(guān)系數(shù)R2為0.997，說明擬合較好。

糖是發(fā)酵過程中的主要碳源，被酵母菌所分泌的酶系不斷分解、轉(zhuǎn)化，發(fā)酵過程中不但產(chǎn)生酒精，而且還產(chǎn)生CO2、醇、醛、酯、酸等其他代謝物。糖源不斷被消耗，這些代謝產(chǎn)物的濃度則不斷增加，主發(fā)酵結(jié)束之后，殘?zhí)菚?huì)被繼續(xù)分解，進(jìn)而得到干酒。

2.3 椰子水發(fā)酵速率

以時(shí)間t分別對(duì)3種酵母發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)擬合曲線Xt、酒精生成擬合曲線Pt和底物消耗擬合曲線St求一階導(dǎo)數(shù)得到以下3個(gè)方程：

酵母DV10菌體生長(zhǎng)速率方程：

dx/dt=5.76×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2

酵母DV10酒精生成速率方程：

dp/dt=10.466×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2

酵母DV10底物消耗速率方程：

ds/dt=-159.89×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2-0.051×exp（1.91t）/{1-0.093[1-exp（1.91t）]}

如圖5-A所示，由酵母菌體生長(zhǎng)速率曲線可知，接種后酵母數(shù)量開始增長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率不斷提高。第2天達(dá)到速率最高值，之后開始下降，第5天增速幾乎接近于0，此時(shí)酵母數(shù)量最高。酒精生成速率曲線圖如圖5-B所示，初始階段酒精生成速率不斷增加，并在第2天達(dá)到最高值，之后開始下降，第5天酒精生成速率接近于0，此時(shí)酒精積累量最大。發(fā)酵降糖速率曲線如圖5-C所示，發(fā)酵開始后，降糖速率一直增加，第2天出現(xiàn)最大速率值，之后開始下降。

2.4 模型驗(yàn)證

由表4可知，3個(gè)模型的理論值和實(shí)驗(yàn)值的誤差大部分小于10%，3個(gè)模型理論值和實(shí)驗(yàn)值的誤差的平均值分別為4.75%、4.36%、4.42%，說明模型擬合較好。

3 討論

應(yīng)用Logistic和Leudeking-Piret方程建立了包括菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型、底物消耗動(dòng)力學(xué)模型和產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型3個(gè)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。擬合結(jié)果顯示，酵母DV10的模擬預(yù)測(cè)值與實(shí)際實(shí)測(cè)值之間的擬合度較好（0.994、0.997、0.997），且3個(gè)模型的理論值和實(shí)驗(yàn)值的誤差大部分小于10%，3個(gè)模型理論值和實(shí)驗(yàn)值的誤差的平均值分別為4.75%、4.36%、4.42%，因此可以很好地預(yù)測(cè)發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化。通過對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)擬合方程一階求導(dǎo)，得到低醇度椰子水發(fā)酵過程中菌種增長(zhǎng)速率、酒精生成速率和底物消耗速率，從而能更清晰地認(rèn)識(shí)椰子水發(fā)酵過程。

本研究的動(dòng)力學(xué)模型主要參考張良[17]的研究，且動(dòng)力學(xué)模型擬合度與之相近，其建立的藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、酒精生成以及糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型的決定系數(shù)分別為R2=0.991、0.985、0.979。在本研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中酒體中的椰子水風(fēng)味變淡而酒精風(fēng)味過重，因此可以參考楊勁松等[20]的方法，用高度酒浸漬椰肉再兌發(fā)酵椰子水，可以較好地豐富發(fā)酵椰子水中風(fēng)味。

本研究選擇實(shí)驗(yàn)室用3 L發(fā)酵罐進(jìn)行椰子水發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，與全自動(dòng)發(fā)酵罐中的放大培養(yǎng)有些區(qū)別。全自動(dòng)發(fā)酵罐中帶有攪拌操作且容積更大，罐內(nèi)菌體生長(zhǎng)和代謝會(huì)有所改變，仍需進(jìn)一步分析各種發(fā)酵參數(shù)之間的聯(lián)系，以構(gòu)建全自動(dòng)發(fā)酵罐中發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，為今后發(fā)酵過程計(jì)算機(jī)控制和自動(dòng)化操作創(chuàng)造條件。

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