分枝桿菌降解甾醇側(cè)鏈中底物及其增溶劑的研究

徐陽(yáng)光，范雅敏，羅 蘭，王海清，關(guān)怡新，姚善涇

浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027

分枝桿菌降解甾醇側(cè)鏈中底物及其增溶劑的研究

徐陽(yáng)光，范雅敏，羅 蘭，王海清，關(guān)怡新，姚善涇

浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027

為克服甾醇生物轉(zhuǎn)化中存在的底物溶解度偏低的問(wèn)題，擬選取多種有機(jī)溶劑、環(huán)糊精及其衍生物作為增溶劑，以探討不同底物甾醇對(duì)其偏好性，并對(duì)增溶劑添加時(shí)間、添加量、底物的投料濃度等進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)果表明，植物甾醇(混合甾醇)最適于作為側(cè)鏈降解轉(zhuǎn)化底物，且底物甾醇對(duì)不同的增溶劑無(wú)明顯偏好性。有機(jī)溶劑作為增溶劑時(shí)，乙醇和丙酮在提高產(chǎn)率方面均優(yōu)于其它有機(jī)溶劑；而環(huán)糊精作為增溶劑時(shí)，甲基-β-環(huán)糊精效果最好，在投料濃度為15 g/L時(shí)(環(huán)糊精與底物物質(zhì)的量比2:1)，產(chǎn)率仍不低于60%。

植物甾醇 側(cè)鏈降解 分枝桿菌 有機(jī)溶劑 環(huán)糊精及其衍生物

為解決甾體激素類藥物合成中薯蕷皂素和劍麻皂素等半合成原料短缺的問(wèn)題，采用微生物轉(zhuǎn)化法降解植物甾醇側(cè)鏈，以生產(chǎn)甾體類藥物中重要的中間體雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)是目前的研究熱點(diǎn)[1]。植物甾醇側(cè)鏈降解過(guò)程可分為擴(kuò)散和酶催化反應(yīng)兩個(gè)階段，擴(kuò)散過(guò)程包括底物固體顆粒的溶解、溶解后的底物分子向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散以及產(chǎn)物分子向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)等。與甾醇側(cè)鏈降解有關(guān)的酶屬于胞內(nèi)酶，只有底物進(jìn)入細(xì)胞后，轉(zhuǎn)化反應(yīng)才得以進(jìn)行，但甾體類物質(zhì)在水溶液中的溶解度很低（溶解度僅為10-5～10-4mol/L），不能很好地與轉(zhuǎn)化酶接觸，會(huì)造成轉(zhuǎn)化率低、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)等一系列問(wèn)題[2]。底物的溶解及傳遞是側(cè)鏈降解過(guò)程中關(guān)鍵的控制步驟，直接決定著產(chǎn)物產(chǎn)率的高低。因此，改善底物的溶解性，增加反應(yīng)體系中的有效底物濃度，強(qiáng)化底物和產(chǎn)物分子的內(nèi)外傳遞，建立合理有效的生物轉(zhuǎn)化體系是提高甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)效率的關(guān)鍵因素之一。

選取合適的有機(jī)溶劑和環(huán)糊精及其衍生物是增加底物溶解性的常用方法。但特定的底物是否對(duì)增溶劑具有偏好性，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。而且，分枝桿菌降解甾醇側(cè)鏈過(guò)程中關(guān)于底物也少有系統(tǒng)地研究。本研究擬選取5種甾醇（豆甾醇、β-谷甾醇、植物甾醇、膽固醇、麥角固醇）作為底物，6種有機(jī)溶劑[乙醇、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、1,2-丙二醇]和8種環(huán)糊精（β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基-β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、羥丙基-γ-環(huán)糊精）作為增溶劑，對(duì)底物的偏好性和分枝桿菌降解甾醇側(cè)鏈的催化過(guò)程進(jìn)行研究，以改善底物的溶解性，進(jìn)一步提高底物投料濃度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

分枝桿菌（Mycobacteriumsp. MB 3863），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；豆甾醇（stigmasterol，純度＞95%），β-谷甾醇（β-sitosterol，純度＞80%）和混合植物甾醇（phytosterols，其中豆甾醇26.2%、β-谷甾醇45%、菜油甾醇23.5%、菜籽甾醇3.2%），購(gòu)自西安海斯夫生物科技公司；膽固醇（cholesterol，純度＞95%），麥角固醇（ergosterol，純度＞95%），β-環(huán)糊精(β-CD)，2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-HP-β-CD)，γ-環(huán)糊精(γ-CD)，購(gòu)自阿拉丁公司；甲基-β-環(huán)糊精(M-β-CD)，羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)，羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)，磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)和羥丙基-γ-環(huán)糊精(HP-γ-CD)均為無(wú)臭白色粉末，購(gòu)自山東濱州智源生物科技有限公司；其它試劑均為市售分析純或色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基組成

種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，甘油0.6%，NaCl 1.5%，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：檸檬酸0.2%，檸檬酸鐵銨0.005%，MgSO40.05%，K2HPO40.05%，(NH4)2HPO40.6%，吐溫-80（Tween-80）0.3%，葡萄糖0.5%，pH值7.0。

1.2.2 底物預(yù)處理

有機(jī)溶劑為增溶劑時(shí)，將0.05 g底物溶解于2 mL有機(jī)溶劑中，50 ℃超聲輔助溶解5 min，即得到底物有機(jī)溶劑懸浮液，保溫備用。環(huán)糊精及其衍生物為增溶劑時(shí)，將環(huán)糊精與底物以1:1的物質(zhì)量比加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，115 ℃滅菌30 min。

1.2.3 生物催化甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)

將保藏在4 ℃瓊脂斜面培養(yǎng)基上的分枝桿菌孢子用無(wú)菌水洗下，轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28 ℃和180 r/min培養(yǎng)12 h后，再轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基。將用增溶劑適當(dāng)處理過(guò)的底物投入發(fā)酵液中，投料濃度1 g/L，在30 ℃和200 r/min轉(zhuǎn)化168 h（環(huán)糊精為增溶劑時(shí)轉(zhuǎn)化96 h）。取3 mL發(fā)酵液，加入6 mL乙酸乙酯振蕩萃取15 min；取上相在10 000 r/min離心5 min后，取1 mL上清液烘干，有機(jī)濾膜過(guò)濾后加入1 mL色譜甲醇超聲輔助溶解，采用高效液相色譜（HPLC）分析AD摩爾產(chǎn)率（Yield）。

1.2.4 分析方法

摩爾產(chǎn)率的測(cè)定采用高效液相色譜法(HPLC 1100，美國(guó)安捷倫公司)，色譜柱為Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相為甲醇與水（體積比為4:1），流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。繪制產(chǎn)物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外標(biāo)法計(jì)算發(fā)酵培養(yǎng)液中AD含量。摩爾產(chǎn)率（Yield）的定義為產(chǎn)出的AD物質(zhì)的量除以底物甾醇的物質(zhì)的量，其中植物甾醇的相對(duì)分子質(zhì)量按各成分比例，以400 g/mol計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑作為增溶劑的微生物轉(zhuǎn)化

2.1.1 底物對(duì)有機(jī)溶劑的偏好性

用有機(jī)溶劑預(yù)溶解底物后再投料到發(fā)酵液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是一類較常用的提高底物溶解度的方法，主要包括乙醇、丙二醇、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺等[2]。選取了6種有機(jī)溶劑增溶劑，其對(duì)5種甾醇底物的轉(zhuǎn)化過(guò)程影響如表1所示。當(dāng)未添加有機(jī)溶劑時(shí)，β-谷甾醇與植物甾醇(PS)的摩爾產(chǎn)率最高，分別達(dá)到57.0%和54.4%；其中得率最低的是麥角固醇，僅為2.3%，豆甾醇的摩爾產(chǎn)率也不高，只有23.3%。這是因?yàn)辂溄枪檀己投圭薮冀?jīng)常被氧化成孕酮[3]，它們C22位上的雙鍵對(duì)于甾醇專一性降解常用菌有抑制作用[4]，因而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率很低。使用有機(jī)溶劑為增溶劑時(shí)，甾醇經(jīng)有機(jī)溶劑超聲輔助溶解，然后加入反應(yīng)系統(tǒng)。由表1可見，使用增溶劑后，豆甾醇和麥角固醇的轉(zhuǎn)化率依然較低，特別是麥角固醇，最高只有21.5%（乙醇為增溶劑），說(shuō)明麥角固醇和豆甾醇不適于用作甾醇側(cè)鏈降解的底物。β-谷甾醇和膽固醇的產(chǎn)率雖然較高，但原料昂貴，如市場(chǎng)上高純度的β-谷甾醇（80%以上）價(jià)格是植物甾醇(PS)的20倍左右。綜合產(chǎn)率和經(jīng)濟(jì)效益，植物甾醇（混合甾醇）最適于作為微生物側(cè)鏈降解的底物。另外，植物甾醇、β-谷甾醇和膽固醇作底物時(shí)，6種有機(jī)溶劑作為增溶劑均可不同程度提高側(cè)鏈降解產(chǎn)率；而在麥角固醇和豆甾醇作底物時(shí)，產(chǎn)率普遍較低，沒(méi)有出現(xiàn)在某種有機(jī)溶劑中產(chǎn)率過(guò)高的現(xiàn)象，說(shuō)明底物對(duì)有機(jī)溶劑無(wú)明顯偏好性。AD產(chǎn)率主要由底物的分子結(jié)構(gòu)決定，而底物與溶劑的相互作用對(duì)其影響較小。其中，乙醇和丙酮的增溶效果優(yōu)于其它溶劑，其對(duì)5種底物轉(zhuǎn)化率的提高均很明顯，且其在底物預(yù)處理過(guò)程中均能將底物溶解至澄清透明，表明它們對(duì)底物的溶解性較好，是比較理想的甾體側(cè)鏈降解增溶劑。

表1 有機(jī)溶劑對(duì)甾醇生物轉(zhuǎn)化過(guò)程影響Table 1 Effect of organic solvents on sterols bioconversion

2.1.2 植物甾醇投料濃度的影響

為了達(dá)到較高的生物轉(zhuǎn)化效率，生產(chǎn)過(guò)程中希望底物的投料濃度盡可能地高。選取乙醇作為增溶劑，混合植物甾醇為底物研究提高底物投料濃度對(duì)側(cè)鏈降解過(guò)程的影響。將底物用2 mL乙醇超聲輔助溶解后投入發(fā)酵液中，各個(gè)投料濃度下AD產(chǎn)率結(jié)果如圖1所示。隨著底物濃度的提高，產(chǎn)物AD的摩爾產(chǎn)率迅速下降，在植物甾醇的濃度為7 g/L時(shí)，其產(chǎn)率只有5%。這說(shuō)明有機(jī)溶劑對(duì)甾醇的增溶效果有限，僅適用于低濃度的植物甾醇轉(zhuǎn)化。另外，增加溶劑量會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，造成產(chǎn)率降低[5]。本實(shí)驗(yàn)曾用4 mL乙醇溶解1 g/L的底物進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率只有8%，葉麗等[6]在其研究中得到了類似結(jié)論。推測(cè)其原因是植物甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)為多酶催化，較其他單酶催化的轉(zhuǎn)化反應(yīng)更易受有機(jī)溶劑的毒害[7]。

圖1 乙醇作為增溶劑時(shí)底物濃度對(duì)AD產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of phytosterols feeding concentration on bioconversion using ethanol as a solubilizer

2.2 環(huán)糊精及其衍生物作為增溶劑的微生物轉(zhuǎn)化

2.2.1 底物對(duì)環(huán)糊精及其衍生物的偏好性

環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)是一種由6～8個(gè)葡萄糖通過(guò)α-1,4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀寡聚糖，易溶于水，其疏水性空腔能夠通過(guò)范德華力及氫鍵作用與疏水性分子結(jié)合，分為α、β、γ環(huán)糊精[8]。Hesselink等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，CD能顯著增加MycobacteriumNRRL-B3683降解膽固醇和谷甾醇生產(chǎn)雄甾-4-烯-3,l7-二酮(AD)的產(chǎn)率，而且不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度及細(xì)胞密度。α、β、γ環(huán)糊精分別由6、7、8個(gè)葡萄糖分子組成，所以其形成的疏水性空腔大小不同，會(huì)影響植物甾醇的溶解度，因而影響AD產(chǎn)率。本工作首先研究了5種不同的環(huán)糊精對(duì)甾醇側(cè)鏈降解過(guò)程的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 環(huán)糊精類對(duì)甾醇生物轉(zhuǎn)化過(guò)程影響Table 2 Effect of cyclodextrin and its derivatives on sterols bioconversion

在投料濃度1 g/L時(shí)，添加與底物物質(zhì)的量比為1:1的環(huán)糊精，轉(zhuǎn)化96 h后發(fā)現(xiàn)這5種環(huán)糊精對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率提高均不明顯，即低底物濃度下其增溶效果反而不如有機(jī)溶劑，摩爾產(chǎn)率較高的依然是側(cè)鏈上無(wú)雙鍵的膽固醇，β-谷甾醇和混合植物甾醇，進(jìn)一步說(shuō)明了AD的摩爾產(chǎn)率主要由底物分子結(jié)構(gòu)決定，底物與溶劑的相互作用對(duì)其影響較小，增溶劑只會(huì)使5種底物轉(zhuǎn)化的AD產(chǎn)率同時(shí)升高或降低，但單個(gè)底物對(duì)某種增溶劑無(wú)明顯偏好性。其中β-環(huán)糊精對(duì)底物的側(cè)鏈降解反而有抑制作用，與不添加環(huán)糊精相比，底物的轉(zhuǎn)化率均降低。這是因?yàn)棣?環(huán)糊精與底物包結(jié)物不溶于水，直接添加β-環(huán)糊精，能和底物形成包結(jié)程度較低的包結(jié)物，反而不利于微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化反應(yīng)[10]。表2表明，環(huán)糊精衍生物中增溶效果最好的溶劑是甲基-β-環(huán)糊精(M-β-CD)，將植物甾醇的產(chǎn)率從54.4%提高到76.5%。與β-環(huán)糊精相比，γ-環(huán)糊精雖然具有較大的內(nèi)腔，可以容納更多的底物分子，但從結(jié)果來(lái)看，γ-環(huán)糊精及其衍生物提高摩爾產(chǎn)率的效果反而不如β-環(huán)糊精衍生物，說(shuō)明環(huán)糊精的內(nèi)腔不是越大越好，其增溶效果還和環(huán)上的配基結(jié)構(gòu)有關(guān)。鑒于β-環(huán)糊精衍生物的增溶效果較好，本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步選取了3種β-環(huán)糊精衍生物即磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)、羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)、羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)進(jìn)行研究，以期提高植物甾醇的投料濃度，篩選出效果較佳的環(huán)糊精增溶劑。

2.2.2 環(huán)糊精添加比例對(duì)AD產(chǎn)率的影響

環(huán)糊精能顯著增加植物甾醇等疏水化合物的水溶性，在一定范圍內(nèi)其溶解度的增加與環(huán)糊精添加量呈線性關(guān)系[11]。本工作研究了添加與底物植物甾醇(5 g/L)不同物質(zhì)的量比的SBE-β-CD和CM-β-CD，轉(zhuǎn)化96 h后結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，AD產(chǎn)率隨著環(huán)糊精與植物甾醇物質(zhì)的量比的增加而逐漸增加，后趨于穩(wěn)定，并有小幅下降。在加入物質(zhì)的量比為2:1的環(huán)糊精時(shí)，AD產(chǎn)率最高為45%，是對(duì)照實(shí)驗(yàn)的2.5倍。

圖2 環(huán)糊精添加量對(duì)產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of molar ratio of CD to phytosterols on AD yield

2.2.3 環(huán)糊精添加時(shí)間對(duì)AD產(chǎn)率的影響

在不同發(fā)酵時(shí)間加入與植物甾醇(10 g/L)物質(zhì)的量比為2:1的HP-β-CD，轉(zhuǎn)化反應(yīng)96 h后，得到的AD產(chǎn)率，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，HP-β-CD的添加時(shí)間對(duì)AD的摩爾產(chǎn)率影響不大，二級(jí)培養(yǎng)發(fā)酵初期添加時(shí)，產(chǎn)物AD的摩爾產(chǎn)率為55%，與發(fā)酵72 h時(shí)添加相比，提高了10%。因而，本實(shí)驗(yàn)中確定添加環(huán)糊精的最佳時(shí)間為二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)初始時(shí)刻。

圖3 環(huán)糊精添加時(shí)間對(duì)AD產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of time of adding CD on AD yield

圖4 環(huán)糊精作為增溶劑時(shí)底物濃度對(duì)AD產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of phytosterols feeding concentration on bioconversion using cyclodextrins as solubilizer

2.2.4 植物甾醇投料濃度的影響

底物的投料濃度是工業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)重要的參數(shù)，為了提高生產(chǎn)效率，在保證產(chǎn)物較高的摩爾產(chǎn)率的前提下，應(yīng)盡可能地提高投料濃度。本工作研究了以SBE-β-CD、CM-β-CD、M-β-CD為增溶劑時(shí)，投料濃度對(duì)AD產(chǎn)率的影響，添加與底物植物甾醇物質(zhì)的量比為2:1的環(huán)糊精，轉(zhuǎn)化96 h后結(jié)果如圖4所示。3種環(huán)糊精對(duì)甾醇側(cè)鏈降解的微生物轉(zhuǎn)化均具有較好的效果。在高底物濃度時(shí)，添加環(huán)糊精的AD產(chǎn)率并沒(méi)有因?yàn)榈孜餄舛鹊奶岣叨眲∠陆?，?5 g/L底物濃度下，添加了M-β-CD的AD摩爾產(chǎn)率仍有60%，說(shuō)明β-環(huán)糊精衍生物對(duì)植物甾醇轉(zhuǎn)化有良好的促進(jìn)效果。綜合考慮AD的產(chǎn)率和生產(chǎn)效率，確定15 g/L為適宜的底物投料濃度。

表3為近年來(lái)甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)的研究現(xiàn)狀。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相比，本研究中底物的投料濃度15 g/L已達(dá)到較高水平，盡管AD的摩爾產(chǎn)率為60%，但其發(fā)酵轉(zhuǎn)化時(shí)間僅為4天，大大縮短了轉(zhuǎn)化過(guò)程，可顯著提高生產(chǎn)效率，這在甾體藥物的工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義，表明了將環(huán)糊精作為增溶劑應(yīng)用于甾醇側(cè)鏈降解過(guò)程的可行性和優(yōu)勢(shì)。

表3 甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)研究匯總Table 3 The situation of side-chain cleavage using different biotransformation processes

3 結(jié) 論

基于轉(zhuǎn)化效率和經(jīng)濟(jì)性分析，植物甾醇是分枝桿菌降解甾醇側(cè)鏈的最適宜底物。有機(jī)溶劑中增溶效果最好的是乙醇和丙酮，在1 g/L投料濃度均可使產(chǎn)物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)的產(chǎn)率提高到80%以上；但當(dāng)?shù)孜锿读蠞舛忍岣叩? g/L時(shí)，AD產(chǎn)率迅速下降到5%，說(shuō)明有機(jī)溶劑只適用于低投料濃度的底物溶解性改善，隨著植物甾醇濃度提高，其增溶效果將變差。環(huán)糊精及其衍生物中，β-環(huán)糊精衍生物的增溶效果較好，疏水腔較大的γ-環(huán)糊精及其衍生物效果不佳，說(shuō)明增溶效果還與環(huán)糊精上的配基有關(guān)。環(huán)糊精與植物甾醇的最佳投料物質(zhì)的量比為2:1，合適的添加時(shí)間為二級(jí)培養(yǎng)的初始時(shí)刻。其中，甲基-β-環(huán)糊精增溶效果最好，在植物甾醇濃度高達(dá)15 g/L時(shí)，其AD摩爾產(chǎn)率仍不低于60%。研究結(jié)果表明不同結(jié)構(gòu)的底物對(duì)有機(jī)溶劑和環(huán)糊精及其衍生物這兩種增溶劑無(wú)明顯的偏好性。

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新的非貴金屬催化劑用于低溫排氣后處理顯示了作為低成本組分的前景

新的非貴金屬催化劑用于低溫排氣后處理顯示了作為低成本組分的前景。美國(guó)橡樹嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的研究人員(ORNL)于2015年9月23日宣布，開發(fā)出由氧化銅、氧化鈷和二氧化鈰(被稱為“CCC”)組成的三元混合氧化物催化劑，優(yōu)于在模擬的排氣流中用于CO氧化的合成的和商業(yè)上的鉑族金屬(PGM)催化劑，顯示出無(wú)抑制的跡象，亦即無(wú)由NOx、CO和HC而使催化劑發(fā)生堵塞的跡象。

PGM催化劑是目前汽車尾氣排放后處理的標(biāo)準(zhǔn)催化劑。然而，除了他們的高成本外，由于被排氣流中烴類的抑制，PGM催化劑在低溫(＜ 200 ℃)下會(huì)受到CO氧化的影響。新的ORNL催化劑顯示了巨大的潛力，可作為用于低溫排氣流的低成本的組分，預(yù)計(jì)將適于未來(lái)汽車系統(tǒng)的特點(diǎn)，研究人員將他們的論文已刊載在德國(guó)《應(yīng)用化學(xué)（Angewandte Chemie）》雜志上。

這種催化劑潛在的解決了沒(méi)有貴金屬的抑制問(wèn)題，并可望有助于更高效的發(fā)動(dòng)機(jī)滿足即將到來(lái)的更嚴(yán)格的排放法規(guī)。研究人員進(jìn)行了廣泛的測(cè)試，使用不同比例的氧化銅、氧化鈷和二氧化鈰，以確定最優(yōu)比例，最初評(píng)價(jià)的原子比例分別為1:5:5。

美國(guó)能源部的能源效率和可再生能源辦公室車輛技術(shù)項(xiàng)目資助這項(xiàng)研究。

錢伯章 摘自Green Car Congress, 2015-09-24

Study on Substrate and Solubilizer in Side-Chain Cleavage of Sterols by Mycobacterium sp. MB 3863

Xu Yangguang, Fan Yamin, Luo Lan, Wang Haiqing, Guan Yixin, Yao Shanjing
College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

In order to solve the shortage of dioscin used in the synthesis of steroid drugs, the production of androst-4-ene-3,17-dione (AD) and other intermediates using phytosterols as the substrate has drawn great attention in recent years. The main problem of sterols conversion in side-chain cleavage of sterols by microbial fermentation is its strong hydrophobic character, which leads to poor contact between substrate and enzymes and thus results in low conversion rate and the fermentation time was delayed. In this study, 6 kinds of organic solvents and 8 kinds of cyclodextrin and their derivatives were used to enhance the dissolution of sterols in side-chain cleavage of sterols byMycobacteriumsp. MB 3863, and the preferences of different substrates on solubilizer were investigated. The results showed that phytosterols (mixture sterols) was one of the most suitable substrates in producing AD, and different substrates showed no preferences for given solubilizer to some extent. When organic solvents were used as solubilizer, ethanol and acetone were found to be the most ideal. As for cyclodextrin and its derivatives, the methyl-β-cyclodextrin was the best candidate; when the concentration of phytosterols was increased to 15 g/L, the molar yield of AD could still be over 60% at optimized feeding time and molar ratio of methyl-β-cyclodextrin to phytosterols (2:1).

phytosterols; side chain degradation; mycobacteria; organic solvents; cyclodextrin and its derivatives

TQ467.95

A

1001—7631 ( 2015 ) 05—0423—07

2014-05-04;

: 2014-06-20。

徐陽(yáng)光（1989—），男，碩士研究生；關(guān)怡新（1966—），女，教授，通訊聯(lián)系人。E-mail:guanyx@zju.edu.cn。

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2005C31028）。