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    一株凝結(jié)芽孢桿菌的篩選及鑒定

    2015-01-07 08:27:48肖玉娟
    廈門科技 2015年3期
    關(guān)鍵詞:瓊脂芽孢乳酸

    傅 奇 肖玉娟

    一株凝結(jié)芽孢桿菌的篩選及鑒定

    傅 奇 肖玉娟

    凝結(jié)芽孢桿菌是一種美國FDA批準(zhǔn)用于食品的益生菌,可定殖于腸道中并產(chǎn)生乳酸,同時由于其可產(chǎn)生芽孢,不良環(huán)境耐受性好,菌體在通過腸前消化道時可保持較高的存活率,是一種有重要價值的益生菌。但目前我國尚未批準(zhǔn)用于食品中,相關(guān)研究較少。本文從土壤中篩選得到一株芽孢桿菌,經(jīng)16s rDNA和生理生化鑒定,確定其為凝結(jié)芽孢桿菌,命名為Bacillus coagulans HXP-1。

    材料與方法

    1.樣品來源

    廈門市菜地土壤。

    2.培養(yǎng)基

    篩選培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂,/L):牛肉膏3g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g;pH 7.0-7.2。

    富集培養(yǎng)基(kitahara&suzuki培養(yǎng)基,/L)[1]:葡萄糖20g,酵母提取物5g,蛋白胨5g,瓊脂15g。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(/L):葡萄糖 120g,蛋白胨19g,NH4Cl 4g,(NH4)2HPO42g。

    產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基(TM培養(yǎng)基,/L):酵母提取物1g,硫酸銨10g,肉浸膏5g,番茄汁200mL,α-甲基葡糖苷5g,CaCO320g;pH 5.5。

    碳水化合物產(chǎn)酸培養(yǎng)基 (/L):(NH4)2HPO41g,KCl 0.2g,MgSO40.2g,酵母提取物0.2g,瓊脂5g,溴百里酚藍(0.04g/100mL)20mL;碳水化合物1g。

    V-P試驗培養(yǎng)基(/L):蛋白胨 5g,葡萄糖 5g,K2HPO45g;pH 7.0-7.2。

    CASO肉湯(/L):胰蛋白胨 17g,大豆木瓜蛋白酶消化物 3g,氯化鈉 5g,磷酸二氫鉀 2.5g,葡萄糖2.5g,pH 7.3。

    蛋白胨水培養(yǎng)基(/L):蛋白胨 1g,NaCl 0.5g;pH 7.8。

    DNA酶試驗培養(yǎng)基(/L):酪朊水解物 15g,大豆蛋白胨5g,NaCl 5g,DNA 2g,甲苯胺藍0.1g,瓊脂15g。

    3.菌種篩選

    取1g土樣,加入10mL無菌富集培養(yǎng)基中,80℃處理30min后,于30℃厭氧培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)液pH下降至4.0后,以生理鹽水稀釋至10-8,各稀釋度涂布篩選平板,平板密封后37℃培養(yǎng),生成菌落后挑取菌落測定接觸酶和觀察生孢情況,取接觸酶陽性并產(chǎn)芽孢的菌落繼續(xù)純化。

    4.菌種鑒定

    由國家海洋局第三海洋研究所進行16s rDNA鑒定,生理生化鑒定依據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》[2]《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[3]與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]進行,乳酸檢測按照《食品添加劑乳酸(GB 2023-2003)》[5]進行。

    結(jié)果與討論

    從廈門市菜地土壤中篩選得到一株產(chǎn)乳酸的、產(chǎn)芽孢的菌株,編號HXP-1,經(jīng)純化保藏后,送至國家海洋局第三海洋研究所——中國海洋微生物菌種保藏管理中心,進行16s rDNA鑒定。

    1.16s rDNA鑒定結(jié)果

    測序結(jié)果顯示HXP-1 16S rDNA序列長度為1514 bp,堿基序列如下:

    16s rDNA序列通過細(xì)菌模式種網(wǎng)站對比,結(jié)果顯示菌株HXP-1與8株模式種的16s序列相似度高于99.5%。

    表1 HXP-1菌株16s序列EZTaxon網(wǎng)站對比結(jié)果

    16s rDNA序列通過NCBI比對,結(jié)果顯示菌株HXP-1與100余株菌株的16s序列相似度高于99%,相似菌株包括Bacillus subtilis(枯草芽孢桿菌)、Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)、Bacillus methylotrophicus(甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌)、Bacillus polyfermenticus(多酵解芽孢桿菌)、Bacillus velezensis(貝萊斯芽孢桿菌)等。

    表2 HXP-1菌株16s序列NCBI網(wǎng)站對比結(jié)果

    經(jīng)中國海洋微生物菌種保藏管理中心16s rDNA測序,該菌株初步判斷為芽孢桿菌群的一個種。

    2.生理生化鑒定結(jié)果

    生理生化試驗結(jié)果如表3所示,參考《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》[2]《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[3]與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]可知,菌株HXP-1屬于凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans),命名為Bacillus coagulans HXP-1。

    表3 HXP-1菌株生理生化試驗結(jié)果

    討論與分析

    芽孢桿菌由于菌種間親緣關(guān)系較近,常用的16s rDNA難以鑒定到種,因此鑒定時通常需進行生理生化鑒定或看家基因測序,本文中篩選到的菌株Bacillus coagulans HXP-1,其16s rDNA序列與多種芽孢桿菌具有極高的相似度,生理生化結(jié)果與凝結(jié)芽孢桿菌完全吻合,但與此同時,與NCBI基因庫比對時發(fā)現(xiàn)該菌株與已登記在庫的凝結(jié)芽孢桿菌16s序列差異較大,相似度最高僅為93%,表明該菌株在部分生理和代謝特性方面可能與多數(shù)凝結(jié)芽孢桿菌存在差異,具有重要研究價值。

    (作者單位:廈門華廈學(xué)院)

    [1]Stephanie Doores,Dennis Westhoff.Journal of Food Science[J].1981,46∶810-812.

    [2]凌代文,東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法[M].北京∶中國輕工業(yè)出版社,1999∶29-31.

    [3]布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊 [M].第8版.北京∶科學(xué)出版社,1984∶170-178.

    [4]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊 [M].北京∶北京科學(xué)出版社,2001∶43-65.

    [5]GB 2023-2003,食品添加劑乳酸[S].

    圖片來自網(wǎng)絡(luò)

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