Graves′病患者CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能初探

孫偉莉，申 勇，李衛(wèi)鵬，袁 媛，張林杰

Graves′病患者CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能初探

孫偉莉1，2，申 勇2，李衛(wèi)鵬2，袁 媛2，張林杰1

目的探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在Graves’?。℅D）發(fā)生中所起的作用。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測20例GD患者（GD組）和10例健康對(duì)照者（健康對(duì)照組）外周血Treg數(shù)量。3H摻入試驗(yàn)測定Treg與效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）共培養(yǎng)環(huán)境中的Treg對(duì)其增殖抑制作用，ELISA法測定白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子的濃度。結(jié)果Treg所占CD4＋細(xì)胞的比例在GD組與健康對(duì)照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GD組的Treg抑制功能與健康對(duì)照組相比顯著降低。兩組之間的細(xì)胞因子濃度有一定的差異，GD組IL-10水平顯著低于健康對(duì)照組，IL-2和白細(xì)胞介素-17（IL-17）水平顯著高于健康對(duì)照組。結(jié)論 GD患者的Treg有功能缺陷，與甲狀腺自身免疫性疾病的發(fā)病有一定的關(guān)系。Treg在GD中的診斷價(jià)值以及病理生理機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

Graves’?。徽{(diào)節(jié)性T細(xì)胞；效應(yīng)T細(xì)胞

Graves’?。℅raves’disease，GD）是一種常見的甲狀腺疾病，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)甲狀腺抗原的免疫耐受消失、淋巴細(xì)胞浸潤甲狀腺組織。GD作為一種自身免疫性甲狀腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD）是由于免疫調(diào)節(jié)失衡所致。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群，該細(xì)胞亞群具有維持免疫耐受作用：抑制免疫反應(yīng)，防止自身免疫疾病的發(fā)生。Tregs通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸［1］，或通過產(chǎn)生具有免疫抑制的細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10），抑制抗原特異性T細(xì)胞，發(fā)揮免疫抑制作用［2－3］。該研究旨在通過檢測分析GD患者外周血Tregs的數(shù)量以及功能狀況，探討該細(xì)胞亞群在GD發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為該疾病的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料GD患者20例作為GD組，其中男5例，女15例，年齡20～57（41.1±10.1）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)為甲狀腺激素的血清學(xué)指標(biāo)，即依據(jù)游離三碘甲狀腺原氨酸（free iodine thyoid three original acid，F(xiàn)reeT3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)reeT4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）以及促甲狀腺激素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAB）檢測結(jié)果?；颊吲懦?、肝、脾、肺、腎等臟器病變。健康體檢者10例作為健康對(duì)照組，其中男3例，女7例，年齡18～59（37.7±12.7）歲，無家族病史，排除重要臟器病變；甲狀腺球蛋白抗體和甲狀腺過氧化物酶抗體均為陰性。兩組之間年齡、性別相匹配，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試劑和儀器異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體及其相匹配的同型對(duì)照、FACS Aria型流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Hyclone公司；3H胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine，3H-TdR）購自中國科學(xué)院上海核技術(shù)開發(fā)公司；TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 細(xì)胞分離與流式分析采集實(shí)驗(yàn)對(duì)象外周靜脈血，肝素鈉抗凝。加入Ficoll分離液，密度梯度離心（2 000 r／min、20 min）獲得單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。其中一部分PBMCs接受30 Gy的137Cs照射，作為后續(xù)免疫學(xué)試驗(yàn)的抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）；另一部分采用FITC標(biāo)記anti-CD4，PE標(biāo)記anti-CD25，流式細(xì)胞儀分選，CD4＋CD25＋細(xì)胞作為試驗(yàn)中的Tregs，CD4＋CD25－細(xì)胞作為試驗(yàn)中的效應(yīng)T細(xì)胞（T effector，Teff），純度均＞95%。

1.4 細(xì)胞增殖試驗(yàn)新鮮分離的Teff（CD4＋CD25－）和Tregs（CD4＋CD25＋）按照不同比例（20 000∶0，20 000∶5 000以及20 000∶10 000）在含有完全RPMI 1640培養(yǎng)液（含有10%的胎牛血清）的96孔圓底培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。培養(yǎng)板采用抗CD3（每孔0.2 μg）包板，每孔含有可溶性anti-CD28為0.05 μg，同時(shí)每孔加入輻照的PBMCs 50 000個(gè)，作為實(shí)驗(yàn)的APC。置于37℃、5%CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。于培養(yǎng)第4天，收集培養(yǎng)液上清液用于細(xì)胞因子檢測。同時(shí)，每孔加入3H-TdR 18 500 Bq，繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h。收集細(xì)胞，β液體閃爍儀檢測，通過每分鐘計(jì)數(shù)值（counts per minutes，cpm）判定細(xì)胞增殖程度。增殖百分率（%）＝（共培養(yǎng)孔的cpm值／單獨(dú)Teff的cpm值）×100%。

1.5 細(xì)胞因子檢測收集各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液上清，檢測TGF-β、IL-10、IL-4、IL-17、IL-5、IL-2以及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）。試驗(yàn)設(shè)置復(fù)孔。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組之間的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料比較GD組與健康對(duì)照組相比，GD組FreeT3、FreeT4、TRAB水平明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.01），TSH水平明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.01）。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 基本臨床資料比較（±s）

表1 基本臨床資料比較（±s）

2.2 兩組外周血CD4＋CD25＋占CD4＋百分比比較GD組和健康對(duì)照組外周血CD4＋細(xì)胞比例及CD4＋CD25＋細(xì)胞數(shù)占CD4＋細(xì)胞比例比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖1。

表2 兩組外周血CD4＋細(xì)胞及CD4＋CD25＋／CD4＋百分率的比較（%，±s）

表2 兩組外周血CD4＋細(xì)胞及CD4＋CD25＋／CD4＋百分率的比較（%，±s）

2.3 CD4＋CD25＋Tregs對(duì)Teff的抑制功能Tregs的抑制功能體現(xiàn)在對(duì)Teff增殖的抑制上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GD組和健康對(duì)照組的Teff在單獨(dú)培養(yǎng)的情況下，經(jīng)過anti-CD3、anti-CD28及自身APC的共同作用，兩組的cpm值分別為（34 152± 5 836）、（33 286±6 820），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.783）。當(dāng)比例為20 000∶10 000時(shí)，GD組的Teff增殖率為（75.53±6.49）%，而健康對(duì)照組Teff增殖率為（33.50±6.82）%，GD組增殖率明顯增高（P＝0.001）。當(dāng)比例為20 000∶5 000時(shí)，GD組的Teff增殖率為（79.61±8.12）%，而健康對(duì)照組Teff增殖率為（38.54±6.78）%，GD組增殖率明顯增高（P＝0.001）。提示GD組患者的Tregs的抑制功能低于健康對(duì)照組。見圖2。

2.4 細(xì)胞因子濃度檢測通過檢測培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子的濃度，健康對(duì)照組的IL-10水平顯著高于GD組（P＜0.05），健康對(duì)照組的IL-2、IL-17水平顯著低于GD組（P＜0.05）；兩組間其他細(xì)胞因子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。提示IL-10、IL-2和IL-17有可能與Tregs發(fā)揮抑制作用有一定關(guān)系。

3 討論

Tregs在維持免疫耐受、抑制過度免疫應(yīng)答中起到至關(guān)重要的作用［4－5］。研究［6－7］報(bào)道Tregs在1型糖尿病、多發(fā)性硬化病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中存在缺陷，而對(duì)于AITD中的Tregs的研究較少，且觀點(diǎn)不一。

表3 培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子濃度（pg／ml）

本研究GD組外周血Tregs占CD4＋細(xì)胞的百分比與健康對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GD的發(fā)病并非是由于Tregs的數(shù)量改變所導(dǎo)致。本研究以Tregs對(duì)Teff增殖的影響分析了GD患者外周血中的Tregs功能，結(jié)果顯示GD組與健康對(duì)照組的Teff在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)其增殖程度是相當(dāng)?shù)模蝗欢?dāng)將Teff與Tregs混合培養(yǎng)時(shí)，GD組Teff的增殖率明顯高于健康對(duì)照組，提示GD患者的Tregs對(duì)淋巴細(xì)胞增值的控制抑制作用顯著降低，淋巴細(xì)胞的增值活化能力活躍，對(duì)自身抗原的耐受降低，這可能是GD發(fā)病的重要因素之一。

研究［1－3］報(bào)道Tregs通過細(xì)胞－細(xì)胞接觸以及分泌細(xì)胞因子發(fā)揮抑制作用。故而本研究進(jìn)一步探討了細(xì)胞因子TGF-β、IL-10、IL-4、IL-17、IL-5、IL-2和IFN-γ與Tregs功能之間的可能關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中分別檢測了GD組和健康對(duì)照組中的Teff單獨(dú)培養(yǎng)以及Teff與Tregs混合培養(yǎng)時(shí)這些細(xì)胞因子的水平，結(jié)果顯示IL-10、IL-2以及IL-17在GD組和健康對(duì)照組的Teff與Tregs混合培養(yǎng)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GD組的IL-10明顯低于健康對(duì)照組，IL-10作為一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子，具有較強(qiáng)的免疫抑制以及免疫調(diào)控作用，主要可以抑制Teff的增殖和抑制Teff產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-2，提示GD組的Tregs功能降低與IL-10水平下降有一定的關(guān)系。IL-2作為重要的細(xì)胞生長因子，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)GD組的Tregs功能降低，分泌的IL-10減少，不能有效抑制Teff的活化，產(chǎn)生IL-2，從而促進(jìn)Teff的增值，又產(chǎn)生更多的IL-2。本研究中GD組的IL-2明顯高于健康對(duì)照組也論證了此機(jī)制。IL-17是由最新發(fā)現(xiàn)的一類輔助型T細(xì)胞（helper T cell，Th）17分泌的，能誘導(dǎo)炎癥因子以及趨化因子的表達(dá)，使得更多的免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位加劇機(jī)體的炎癥反應(yīng)，較高水平的IL-17提示Tregs對(duì)Th17的抑制作用減弱［8－9］。在本研究中，觀察到GD組IL-17水平高于健康對(duì)照組，也證實(shí)了GD組的Tregs存在功能缺陷。

在分析Tregs抑制功能的Teff增殖試驗(yàn)中，本研究采用的刺激物有anti-CD3、anti-CD28，同時(shí)采用輻照的PBMCs作為APC，即GD組采用GD患者自身的PBMCs作為APC，而健康對(duì)照組采用健康個(gè)體自身的PBMCs用做APC，APC在細(xì)胞增殖中起至關(guān)重要的作用，而且不同個(gè)體APC的主要組織相容性復(fù)合體不盡相同。有研究［10－11］報(bào)道顯示，APC與自身免疫疾病有一定的關(guān)系，主要組織相容性復(fù)合體分子表型可以影響細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子的生成［12－14］。GD組與健康對(duì)照組的Teff增殖是否與APC有一定關(guān)系，有待于在以后的GD動(dòng)物模型試驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

本研究顯示GD患者外周血中的Tregs數(shù)量并未發(fā)生明顯改變，而GD患者的Tregs功能存在缺陷，提示這可能與GD發(fā)生有一定關(guān)系。對(duì)于GD患者，針對(duì)性的采取糾正Tregs的靶向治療，能否使得GD患者好轉(zhuǎn)乃至痊愈，值得進(jìn)一步探討。

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Study on the function of CD4＋CD25＋regulatory T cells in patients with Graves’disease

Sun Weili1，2，Shen Yong2，Li Weipeng2，et al
（1Dept of Immunology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Nuclear Medicine，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004）

ObjectiveTo investigate the role of regulatory T cells（Tregs）in Graves’disease（GD）.MethodsTreg number was assessed by flow cytometric analysis in samples from 20 GD patients and 10 healthy controls.The inhibitory effect of Treg on T effector cells（Teff）was assayed by3H thymidine proliferation experiment.IL-10，IL-2 and other cytokine levels were determined by ELISA in conditioned media from the co-cultures.ResultsNo differences were found in the frequency of Tregs as a percentage of CD4＋cells between GD and healthy controls.Compared with the healthy controls，inhibitory function of Treg from patients with GD decreased significantly.Cytokine secretion between two groups also had significant difference.IL-10 secretion of healthy control group was significantly higher than patients group，while secretion of IL-2 and IL-17 was significantly lower than patients group.ConclusionTregs from GD patients are partly dysfunctional，possibly explaining their autoimmunity.Future work will elucidate the diagnostic potential and pathophysiology of Tregs in GD.

Graves’disease；regulatory T cells；T effector cells

R 392.6

1000－1492（2015）02－0202－04

2014－10－15接收

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2011A167）

1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，合肥 2300322安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，蚌埠 233004

孫偉莉，女，主管技師，碩士研究生；張林杰，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zlj33＠sina.com