• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    丙戊酸鈉聯(lián)合全反式維甲酸促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞衰老的發(fā)生

    2015-01-07 02:41:18尤青葉馮定慶張紅麗伍嬌嬌趙婷婷
    關(guān)鍵詞:子宮頸癌端粒糖苷酶

    尤青葉,馮定慶,凌 斌,3,張紅麗,李 兵,伍嬌嬌,趙婷婷

    丙戊酸鈉聯(lián)合全反式維甲酸促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞衰老的發(fā)生

    尤青葉1,馮定慶2,凌 斌1,3,張紅麗1,李 兵1,伍嬌嬌1,趙婷婷1

    目的研究丙戊酸鈉(VPA)聯(lián)合全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞衰老作用,并探討其分子機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)分為對照組、VPA組、ATRA組、VPA+ATRA組,采用3 mmol/L VPA、1 μmol/L ATRA單獨(dú)或聯(lián)合作用于人子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞,對照組僅加溶媒;采用CellTiter 96?AQueous法檢測細(xì)胞增殖;β-半乳糖苷酶化學(xué)染色法檢測細(xì)胞衰老;Q-PCR和Western blot法分別檢測衰老相關(guān)基因P16、P63、hTERT的mRNA和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果VPA對HeLa及SiHa細(xì)胞均有生長抑制作用,與ATRA聯(lián)合抑制效果明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥(P<0.05);β-半乳糖苷酶染色顯示,VPA+ATRA組衰老細(xì)胞比例顯著增加,與對照組及VPA組、ATRA組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);QPCR和Western blot法結(jié)果顯示,VPA單獨(dú)和聯(lián)合ATRA可上調(diào)P16、P63的表達(dá),降低hTERT的表達(dá),且聯(lián)合用藥優(yōu)于單獨(dú)用藥及對照組(P<0.05)。結(jié)論 VPA聯(lián)合ATRA可抑制子宮頸癌細(xì)胞增殖,上調(diào)P16和P63的表達(dá),下調(diào)hTERT的表達(dá),可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的分子機(jī)制。

    子宮頸癌;丙戊酸;維甲酸;細(xì)胞衰老

    近年來子宮頸癌的發(fā)病率有明顯上升和年輕化趨勢,發(fā)病率以每年2%~3%的速度增長[1]。早期子宮頸癌患者可采用手術(shù)治療,而晚期患者主要以鉑類化療為主,但毒副作用大,患者易對其產(chǎn)生耐藥性,患者生存率大大降低[2-3]。丙戊酸鈉(valproate acid,VPA)是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物,同時(shí)也是一種組蛋白去乙?;福╤istone deacetylase,HDAC)抑制劑,高效、安全、低毒、可口服的特點(diǎn)使其極具臨床前景。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A的生物活性代謝產(chǎn)物,與其受體結(jié)合,具有促進(jìn)上皮細(xì)胞分化成熟的作用,已作為一種誘導(dǎo)分化劑用于臨床腫瘤的治療。研究[4-5]證實(shí)VPA聯(lián)合ATRA可使子宮頸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯,并誘導(dǎo)細(xì)胞分化,但細(xì)胞凋亡增加不明顯。該研究進(jìn)一步分析VPA聯(lián)合ATRA的抗子宮頸癌作用,觀察其對細(xì)胞衰老的影響并探討其可能的分子機(jī)制,為尋求新的子宮頸癌治療方法提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑VPA購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司,用PBS稀釋成600 mmol/L的儲(chǔ)存液,-20℃保存;ATRA購自美國Sigma公司,用DMSO稀釋成833 mmol/L的儲(chǔ)存液,-20℃保存;CellTiter 96?AQueous購自美國Promega公司;TRIzol購自美國Invitrogen公司;PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成;P16、P63、hTERT抗體購自英國Abcam公司;相應(yīng)蛋白的辣根酶標(biāo)記二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;ECL-增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自瑞士羅氏公司;BIORAD化學(xué)發(fā)光儀購自美國BIO-RAD公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組人子宮頸癌細(xì)胞株HeLa與SiHa購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2孵箱孵育,48 h換液1次,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對照組、VPA組、ATRA組、VPA+ATRA組。各組藥物終濃度為VPA 3 mmol/L、ATRA 1 μmol/L。觀察48 h。

    1.3 CellTiter 96?AQueous法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的HeLa及SiHa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化制成細(xì)胞懸液,以1 500個(gè)/孔的密度接種于96孔板,37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后,各用藥組分別加入相應(yīng)的藥物,對照組僅加溶媒,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于24、48、72、96 h加CellTiter 96?AQueous工作液,1 h后酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測各孔吸光度(optical density,OD)值。生長抑制率(%)=(用藥組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4 β-半乳糖苷酶染色法檢測細(xì)胞衰老取對數(shù)生長期細(xì)胞,制成單細(xì)胞混懸液,以1×106個(gè)/ml的密度接種于6孔板,37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后,各用藥組分別加入相應(yīng)的藥物,對照組用溶媒處理。孵育48 h后吸除培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液,室溫固定15 min后吸除固定液,PBS洗滌3次,加入1 ml染色工作液,37℃孵育過夜,第2天取出用PBS洗滌,再加1次PBS保留,顯微鏡下觀察并拍照。衰老指數(shù)(%)=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

    1.5 Q-PCR法檢測P16、P63、hTERT mRNA的表達(dá)收集細(xì)胞加入TRIzol,提取總RNA,按照Prime-Script?RT操作說明配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。P16、P63、hTERT引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1(PCR引物序列檢測的P63為TAP63亞型)。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù),進(jìn)行熒光定量PCR的檢測,按照2-ΔCt即2-(目的基因Ct-管家基因Ct)計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

    1.6 Western blot法檢測子宮頸癌細(xì)胞株中P16、P63、hTERT的表達(dá)收集細(xì)胞加入RIPA裂解細(xì)胞,提取總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度。分別配制6%和8%的SDS-PAGE電泳凝膠,恒壓電泳分離;半干法恒壓15 V轉(zhuǎn)膜30 min;4℃搖床上封閉過夜。加入一抗P16(1∶1 000)、P63(1∶500)、hTERT(1∶1 000)和內(nèi)參照GAPDH抗體(1∶2 000),4℃孵育過夜;分別加入相應(yīng)的二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,ECL-增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯色,BIORAD化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。

    表1 RT-PCR引物序列

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 VPA聯(lián)合ATRA抑制子宮頸癌細(xì)胞增殖CellTiter 96?AQueous法檢測結(jié)果顯示VPA和ATRA對HeLa、SiHa細(xì)胞均有增殖抑制作用,兩藥聯(lián)合則具有協(xié)同/相加的作用,與VPA組、ATRA組及對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

    2.2 VPA聯(lián)合ATRA促進(jìn)HeLa、SiHa細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示,對照組HeLa細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽性率為(5.3±1.61)%,SiHa細(xì)胞為(3.6±1.56)%;VPA+ATRA組衰老指數(shù)顯著增加,其中HeLa細(xì)胞為(27.5±4.46)%,SiHa細(xì)胞為(35.33±4.55)%,與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=106.7,P<0.05)。提示VPA聯(lián)合ATRA能夠顯著促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的衰老,見圖2。

    2.3 衰老相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化Q-PCR法檢測結(jié)果顯示HeLa、SiHa細(xì)胞經(jīng)藥物處理48 h后,與對照組比較,VPA可上調(diào)P16、P63的mRNA表達(dá)水平(F=39.51,P<0.05);與對照組比較,VPA+ATRA組SiHa細(xì)胞中P16的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),HeLa細(xì)胞中P16、P63表達(dá)水平和SiHa細(xì)胞中P63表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01);VPA+ATRA組與VPA組、ATRA組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但SiHa細(xì)胞中P16表達(dá)水平VPA+ATRA組與VPA組、ATRA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比較,HeLa、SiHa細(xì)胞中VPA組和VPA+ATRA組均能降低hTERT mRNA表達(dá)水平(P<0.05);VPA+ATRA組強(qiáng)于VPA組、ATRA組(P<0.01)。見圖3。

    2.4 P16、P63及hTERT的蛋白表達(dá)水平變化與各基因mRNA表達(dá)變化一致,HeLa、SiHa細(xì)胞經(jīng)VPA單獨(dú)和聯(lián)合ATRA處理后,P16、P63的蛋白表達(dá)水平明顯升高,而hTERT的蛋白表達(dá)水平顯著降低,VPA+ATRA組與對照組及VPA組、ATRA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.56,P<0.05),見圖4。

    3 討論

    在多種腫瘤中存在的結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常、組蛋白乙酰化水平異常,從而導(dǎo)致了特定抑癌基因的表達(dá)抑制。研究[6]顯示HDAC抑制劑能夠與HDAC特異性結(jié)合并抑制其活性,促進(jìn)組蛋白的乙酰化修飾,上調(diào)相關(guān)抑癌基因的表達(dá),在多種腫瘤中顯示了抗腫瘤作用。HDAC抑制劑可能通過多種途徑起到抗腫瘤作用,包括調(diào)控多種細(xì)胞凋亡途徑及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及其穩(wěn)定性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長停滯、分化或細(xì)胞凋亡[7],也可能抑制腫瘤血管的生成,影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。除了內(nèi)在的抗腫瘤活性,HDAC抑制劑還可增加對傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物和腫瘤細(xì)胞放射的敏感性。研究[4-5]表明,VPA是一種HDAC抑制劑,聯(lián)合ATRA可通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化而發(fā)揮抗子宮頸癌作用。本研究顯示VPA與ATRA聯(lián)合用藥可促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞衰老。

    既往研究[9]顯示,VPA聯(lián)合ATRA可調(diào)控多種基因表達(dá),包括多種抑癌基因。本研究顯示兩藥聯(lián)合上調(diào)P16和P63的表達(dá)。P16是目前已經(jīng)明確的一種重要的抑癌基因,其主要通過p16-cyclinD/CDK-RB途徑對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。研究[10]顯示細(xì)胞發(fā)生衰老時(shí),P16表達(dá)明顯升高,當(dāng)年輕的細(xì)胞中導(dǎo)入P16基因細(xì)胞可出現(xiàn)衰老表型,提示P16是細(xì)胞壽限的關(guān)鍵調(diào)控基因之一。Duan et al[11]以P16正反義載體分別轉(zhuǎn)染年輕的人成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)P16過表達(dá)抑制了RB磷酸化從而引起細(xì)胞早衰而其反義載體轉(zhuǎn)染可以延緩細(xì)胞衰老。說明P16的積累不是衰老的結(jié)果而是衰老的誘因。P63是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的P53蛋白家族成員,其在上皮細(xì)胞發(fā)育,基因中兩個(gè)不同的啟動(dòng)子,將其翻譯產(chǎn)物分為兩種亞型,即反式激活域完整的TAP63和反式激活域N端截短的△NP63。TAP63轉(zhuǎn)錄激活(TA)結(jié)構(gòu)域與P53的TA結(jié)構(gòu)域具有同源性,可以激活P53的下游基因,具有與P53相似的抑制腫瘤細(xì)胞生長,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的作用。Truong et al[12]認(rèn)為TAP63具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞衰老的作用。目前研究[13]表明,HDAC抑制劑所誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老部分是由P63介導(dǎo)的,這可能與不同細(xì)胞系特性和不同類型HDAC抑制劑作用的差別有關(guān)。

    腫瘤細(xì)胞發(fā)生衰老是由很多因素參與在內(nèi)的。hTERT是人類端粒酶蛋白的催化亞單位,其表達(dá)水平與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。本研究顯示VPA聯(lián)合ATRA誘導(dǎo)衰老的子宮頸癌細(xì)胞中hTERT表達(dá)水平顯著降低。hTERT能激活端粒酶,端粒酶是細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長的一種酶,其能延長縮短的端粒,當(dāng)端粒酶合成端粒難以彌補(bǔ)縮短的端粒時(shí),端粒將進(jìn)行性縮短,從而誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞衰老。有研究[14]提示hTERT在腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等永生化細(xì)胞中的表達(dá)水平很高,防止細(xì)胞因端粒縮短而發(fā)生細(xì)胞衰老、凋亡。由此可見,端粒、端粒酶在細(xì)胞衰老和腫瘤的發(fā)生中具有重要的作用,有可能成為腫瘤診斷的重要指標(biāo),同時(shí),也可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

    [1] 莫小亮,羅殿中.2012年美國宮頸癌篩查新指南解讀[J].腫瘤防治研究,2014,41(2):188-92.

    [2] Klopp A H,Eifel P J.Chemoradiotherapy for cervical cancer in 2010[J].Curr Oncol Rep,2011,13(1):77-85.

    [3] Tewari K S,Monk B J.Recent achievements and future developments in advanced and recurrent cervical cancer:trials of the Gynecologic Oncology Group[J].Semin Oncol,2009,36(2):170-80.

    [4] Feng D,Cao Z,Li C,et al.Combination of valproic acid and ATRA restores RARβ2 expression and induces differentiation in cervical cancer through the PI3K/Akt pathway[J].Curr Mol Med,2012,12(3):342-54.

    [5] Feng D,Wu J,Tian Y,et al.Targeting of histone deacetylases to reactivate tumour suppressor genes and its therapeutic potential in a human cervical cancer xenograft model[J].PLoS One,2013,8(11):e80657.

    [6] Tassara M,D?hner K,Brossart P,et al.Valproic acid in combination with all-trans retinoic acid and intensive therapy for acute myeloid leukemia in older patients[J].Blood,2014,123(26):4027-36.

    [7] Gan C P,Hamid S,Hor S Y,et al.Valproic acid:growth inhibition of head and neck cancer by induction of terminal differentiation and senescence[J].Head Neck,2012,34(3):344-53.

    [8] Sakajiri S,Kumagai T,Kawamata N,et al.Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines[J].Exp Hematol,2005,33(1):53-61.

    [9] Trus M R,Yang L,Suarez Saiz F,et al.The histone deacetylase inhibitor valproic acid alters sensitivity towards all trans retinoic acid in acute myeloblastic leukemia cells[J].Leukemia,2005,19(7):1161-8.

    [10]Min E Y,Kim I H,Lee J,et al.The effects of fucodian on senescence are controlled by the p16INK4a-pRb and p14Arf-p53 pathways in hepatocellular carcinoma and hepatic cell lines[J].Int J Oncol,2014,45(1):47-56.

    [11]Duan J,Zhang Z,Tong T.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti-sense p16INK4a expression[J].J Biol Chem,2001,276(51):48325-31.

    [12]Truong A B,Khavari P A.Control of keratinocyte proliferation and differentiation by P63[J].Cell Cycle,2007,6(3):295-9.

    [13]曹振平,馮定慶,徐嶸嶸.丙戊酸鈉聯(lián)合全反式維甲酸對HeLa細(xì)胞的殺傷機(jī)制研究[J].腫瘤,2010,30(10):827-32.

    [14]李 敏,周 穎,凌 斌.端粒及端粒酶活性的調(diào)控機(jī)制[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2010,7(2):176-9.

    Studies on promoting cellular senescence by VPA combined with ATRA in cervical cancer cells

    You Qingye1,F(xiàn)eng Dingqing2,Ling Bin1,3,et al(1Dept of Obstetrics and Gynecology,2Key Laboratory of Molecular Medicine,The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230001;
    3Dept of Obstetrics and Gynecology of China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100086)

    ObjectiveTo study valproate acid(VPA)combined with all-trans retinoic acid(ATRA)induced cervical cancer cells senescence,and explore its mechanism.MethodsThe experiment is divided into the control group,the VPA group,ATRA and VPA+ATRA groups.HeLa and SiHa cells were treated with combinated use of 3 mmol/L VPA,1 μmol/L ATRA or respectively.The control group was treated with vehicle only.Using CellTiter 96?Aqueous cell proliferation assay to detect the inhibitory rate of proliferation.Apply β-galactosidase staining method to observe the senescence.The mRNA expressions of P16,P63 and hTERT were detected using Q-PCR and its protein expressions were determined using Western blot.ResultsThe proliferation of HeLa and SiHa cells were significantly inhibited by VPA.The effect of VPA combinated with ATRA was stronger than individual treatment(P<0.05).β-galactosidase staining showed that β-galactosidase staining rate was up-regulated after VPA combined with ATRA in cervical cancer HeLa and SiHa cells,the difference was significant compared with control group and individual group(P<0.05).Q-PCR and Western blot showed that VPA enhanced the mRNA and protein expression of P16,P63 and reduced the expression of hTERT.The efficacy was more powerful in combination therapy group(P<0.05).ConclusionVPA combined with ATRA can inhibit the growth of cervical cancer cell lines.The effect of inducing cervical cancer cells senescence may be related with up-regulation of P16,P63 and downregulation of hTERT.

    cervical cancer;valproic acid;tretinoin;cell senescence

    R 737.33

    1000-1492(2015)02-0135-05

    2014-11-03接收

    國家自然科學(xué)基金(編號:81372777、81372779、81072127)

    安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1婦產(chǎn)科、2分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 2300013衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京 100086

    尤青葉,女,碩士研究生;凌 斌,男,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E-mail:lingbin.ling@gmail.com

    猜你喜歡
    子宮頸癌端粒糖苷酶
    肽基脯氨酰同分異構(gòu)酶(Pin1)對子宮頸癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用
    如何早期發(fā)現(xiàn)子宮頸癌
    康頤(2020年13期)2020-11-10 01:32:11
    HPV疫苗和篩查:人類癌癥防治的典范
    抗癌之窗(2020年2期)2020-07-14 09:42:10
    端粒蛋白復(fù)合物shelterin的結(jié)構(gòu)及功能研究進(jìn)展
    知母中4種成分及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    木蝴蝶提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    抑癌基因P53新解讀:可保護(hù)端粒
    健康管理(2016年2期)2016-05-30 21:36:03
    40—65歲是健身黃金期
    全球子宮頸癌篩查指南析評
    鹽酸阿霉素與人端粒DNA相互作用的電化學(xué)研究
    免费搜索国产男女视频| 满18在线观看网站| 精品国产亚洲在线| 日日爽夜夜爽网站| 成人亚洲精品av一区二区| 俺也久久电影网| 成人免费观看视频高清| 成人特级黄色片久久久久久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 免费高清在线观看日韩| 麻豆成人av在线观看| svipshipincom国产片| 亚洲免费av在线视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久性视频一级片| 天天添夜夜摸| 757午夜福利合集在线观看| 黄色成人免费大全| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av五月六月丁香网| 韩国精品一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产三级在线视频| 变态另类丝袜制服| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美色视频一区免费| 国产色视频综合| 日韩av在线大香蕉| 免费搜索国产男女视频| 午夜福利在线观看吧| 久久精品成人免费网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 两个人看的免费小视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 色哟哟哟哟哟哟| 一级a爱片免费观看的视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲 国产 在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 51午夜福利影视在线观看| 午夜免费激情av| 很黄的视频免费| 亚洲国产精品久久男人天堂| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲专区字幕在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 韩国精品一区二区三区| 黄色女人牲交| 淫秽高清视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 成年版毛片免费区| 国产男靠女视频免费网站| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲无线在线观看| 久久亚洲真实| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品av久久久久免费| a在线观看视频网站| 免费在线观看成人毛片| 欧美中文综合在线视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 色老头精品视频在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 最好的美女福利视频网| 1024香蕉在线观看| 国产亚洲精品av在线| 窝窝影院91人妻| 日韩国内少妇激情av| 熟女电影av网| 国产三级在线视频| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 国产又爽黄色视频| 亚洲精品色激情综合| 18禁美女被吸乳视频| 欧美色视频一区免费| 午夜福利成人在线免费观看| 久久青草综合色| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 老熟妇仑乱视频hdxx| avwww免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲av第一区精品v没综合| 一本久久中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 国产成人av激情在线播放| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 岛国在线观看网站| 91在线观看av| 成人永久免费在线观看视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 美国免费a级毛片| 在线观看66精品国产| 老司机深夜福利视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲人成网站高清观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产99白浆流出| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品美女久久av网站| 久久久久久久精品吃奶| 久99久视频精品免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 一级毛片高清免费大全| 少妇 在线观看| 国产精品影院久久| 久久精品国产清高在天天线| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人手机av| 1024视频免费在线观看| aaaaa片日本免费| xxx96com| 美女国产高潮福利片在线看| 999久久久国产精品视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成在线人永久免费视频| 午夜精品在线福利| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 91老司机精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产成人欧美| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品,欧美在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 女警被强在线播放| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 成人国产综合亚洲| 免费看a级黄色片| 亚洲av成人av| 亚洲精华国产精华精| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品野战在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产看品久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 1024手机看黄色片| 黄色丝袜av网址大全| 99国产精品一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99久久无色码亚洲精品果冻| 十分钟在线观看高清视频www| 久久 成人 亚洲| 国产亚洲av高清不卡| 在线观看一区二区三区| 国产黄色小视频在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲国产精品sss在线观看| 露出奶头的视频| 久久香蕉激情| xxx96com| 亚洲熟女毛片儿| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 香蕉丝袜av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一a级毛片在线观看| 国产精品九九99| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 嫩草影院精品99| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | av免费在线观看网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日日夜夜操网爽| 午夜久久久久精精品| 正在播放国产对白刺激| 中文在线观看免费www的网站 | aaaaa片日本免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久中文字幕人妻熟女| 免费高清在线观看日韩| 制服丝袜大香蕉在线| 天天添夜夜摸| 成人午夜高清在线视频 | 香蕉久久夜色| 色综合婷婷激情| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲五月色婷婷综合| 国产黄片美女视频| 国产成人欧美| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美性猛交黑人性爽| 又大又爽又粗| 性欧美人与动物交配| 可以在线观看毛片的网站| 在线观看66精品国产| 亚洲自拍偷在线| 国产三级黄色录像| 视频在线观看一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 国产在线精品亚洲第一网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 男女下面进入的视频免费午夜 | av在线播放免费不卡| 岛国视频午夜一区免费看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产高清激情床上av| 亚洲第一青青草原| 美女高潮到喷水免费观看| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲黑人精品在线| a在线观看视频网站| 久99久视频精品免费| 欧美黄色淫秽网站| 午夜久久久在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久人妻av系列| 成人精品一区二区免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 在线观看66精品国产| 成人av一区二区三区在线看| www日本黄色视频网| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 这个男人来自地球电影免费观看| 三级毛片av免费| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成人特级黄色片久久久久久久| 深夜精品福利| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久久久久大精品| 欧美日韩乱码在线| 久久精品成人免费网站| x7x7x7水蜜桃| 欧美国产日韩亚洲一区| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲一区中文字幕在线| 国产一区二区三区视频了| avwww免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜老司机福利片| 人人妻人人看人人澡| 国产成人欧美| 国产精品二区激情视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成人国产一区最新在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 日本a在线网址| a级毛片在线看网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 色av中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产99白浆流出| 国产一区在线观看成人免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 哪里可以看免费的av片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 深夜精品福利| 天天添夜夜摸| 夜夜爽天天搞| 午夜激情福利司机影院| 国产激情久久老熟女| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲国产精品合色在线| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 香蕉丝袜av| 国产黄色小视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 中文资源天堂在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久人人精品亚洲av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲中文av在线| 免费看十八禁软件| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美久久黑人一区二区| 欧美性长视频在线观看| ponron亚洲| 国产精品久久久人人做人人爽| or卡值多少钱| 久久性视频一级片| 少妇的丰满在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美乱码精品一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 国产午夜精品久久久久久| 欧美色视频一区免费| 看免费av毛片| 欧美日韩黄片免| 99在线人妻在线中文字幕| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 久久午夜综合久久蜜桃| www日本在线高清视频| ponron亚洲| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品一区二区免费欧美| 一二三四在线观看免费中文在| 一级a爱片免费观看的视频| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲五月婷婷丁香| 午夜久久久久精精品| 一区二区三区激情视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久久水蜜桃国产精品网| 1024视频免费在线观看| 国产97色在线日韩免费| 啦啦啦韩国在线观看视频| 女同久久另类99精品国产91| 99re在线观看精品视频| 听说在线观看完整版免费高清| 后天国语完整版免费观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 搞女人的毛片| 99国产极品粉嫩在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 这个男人来自地球电影免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 成人欧美大片| 丝袜在线中文字幕| 国产精品久久久人人做人人爽| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 精品国产美女av久久久久小说| 国产亚洲av嫩草精品影院| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品人妻少妇| 国产三级黄色录像| 俺也久久电影网| 午夜久久久久精精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 丝袜美腿诱惑在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美中文日本在线观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品免费一区二区三区在线| 69av精品久久久久久| 精品欧美一区二区三区在线| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩免费av在线播放| 十八禁网站免费在线| 后天国语完整版免费观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美日韩精品网址| 男人舔女人下体高潮全视频| 最近最新免费中文字幕在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费观看人在逋| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 婷婷亚洲欧美| av在线播放免费不卡| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲avbb在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩高清综合在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲精品中文字幕在线视频| 变态另类丝袜制服| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 99re在线观看精品视频| 1024手机看黄色片| 一本综合久久免费| 国产成人系列免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 国产1区2区3区精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产一区二区激情短视频| 国产区一区二久久| 午夜两性在线视频| 嫩草影院精品99| av在线天堂中文字幕| 久久草成人影院| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 成人国语在线视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费高清在线观看日韩| 特大巨黑吊av在线直播 | 久久香蕉国产精品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 天堂√8在线中文| 人人妻人人澡人人看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜福利在线在线| 大型av网站在线播放| 日韩欧美在线二视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 在线观看一区二区三区| 国产色视频综合| 黑人操中国人逼视频| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜激情福利司机影院| 亚洲色图av天堂| 亚洲成av片中文字幕在线观看| tocl精华| 精品高清国产在线一区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 黄色丝袜av网址大全| 国产一级毛片七仙女欲春2 | √禁漫天堂资源中文www| 老汉色∧v一级毛片| 丝袜美腿诱惑在线| 黄色丝袜av网址大全| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 黄片播放在线免费| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲无线在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 欧美日韩黄片免| 两个人免费观看高清视频| 色播亚洲综合网| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲电影在线观看av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 18禁美女被吸乳视频| x7x7x7水蜜桃| 脱女人内裤的视频| 嫩草影视91久久| 日本a在线网址| 国产片内射在线| 悠悠久久av| 免费观看人在逋| 精品久久久久久久久久久久久 | 午夜a级毛片| 好男人在线观看高清免费视频 | 宅男免费午夜| 欧美日韩一级在线毛片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 男女那种视频在线观看| 亚洲美女黄片视频| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久国产精品麻豆| 精品欧美一区二区三区在线| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品色激情综合| 很黄的视频免费| 婷婷精品国产亚洲av| 在线天堂中文资源库| 热99re8久久精品国产| 激情在线观看视频在线高清| 十八禁网站免费在线| 国产成人欧美在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 黑丝袜美女国产一区| 在线播放国产精品三级| 91字幕亚洲| 欧美黑人巨大hd| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精华一区二区三区| av电影中文网址| 亚洲激情在线av| xxxwww97欧美| 在线观看66精品国产| 亚洲av电影在线进入| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 91字幕亚洲| 最近最新免费中文字幕在线| 一区二区三区国产精品乱码| 男女午夜视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 热re99久久国产66热| 亚洲片人在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产在线精品亚洲第一网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 成年免费大片在线观看| 日韩免费av在线播放| 一本久久中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲欧美日韩高清在线视频| av在线播放免费不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品国产亚洲在线| 大型av网站在线播放| 99国产精品99久久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产亚洲精品av在线| 亚洲熟妇熟女久久| 国产激情欧美一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品久久久av美女十八| 中文字幕人妻熟女乱码| 女同久久另类99精品国产91| 欧美成人性av电影在线观看| 色综合婷婷激情| 免费电影在线观看免费观看| 国产久久久一区二区三区| 啦啦啦免费观看视频1| 国产区一区二久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲熟女毛片儿| 一级片免费观看大全| 国产伦在线观看视频一区| 午夜激情福利司机影院| 在线观看免费视频日本深夜| 免费人成视频x8x8入口观看| 可以在线观看毛片的网站| www.999成人在线观看| 精品久久久久久久久久久久久 | 老鸭窝网址在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久国产成人精品二区| 日韩国内少妇激情av| 成人午夜高清在线视频 | 亚洲av第一区精品v没综合| 手机成人av网站| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 黄频高清免费视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲av成人一区二区三| 波多野结衣高清无吗| www.www免费av| 欧美成人午夜精品| 人成视频在线观看免费观看| 岛国在线观看网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 成人特级黄色片久久久久久久| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| x7x7x7水蜜桃| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产精品九九99| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲男人天堂网一区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 中亚洲国语对白在线视频| 手机成人av网站| 中国美女看黄片| 日本成人三级电影网站| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美精品啪啪一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 国产熟女xx| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 真人做人爱边吃奶动态| 哪里可以看免费的av片| 男女那种视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 日本在线视频免费播放| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 成人三级做爰电影| 国产又爽黄色视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产野战对白在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩免费av在线播放| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日韩欧美免费精品| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 9191精品国产免费久久| 亚洲人成77777在线视频| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲七黄色美女视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久国内视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 免费电影在线观看免费观看| 亚洲在线自拍视频| 国产精品九九99| 久久久久免费精品人妻一区二区 | av片东京热男人的天堂| 最好的美女福利视频网| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线播放国产精品三级| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲avbb在线观看| 丰满的人妻完整版| 两个人看的免费小视频| 深夜精品福利| 一级毛片精品| 久久久国产精品麻豆|