CD105／CD133篩選鑒定SMMC-7721株干細胞表面標志物的實驗研究

吳立勝，魯 旭，耿小平，盧 寅，張俊松

CD105／CD133篩選鑒定SMMC-7721株干細胞表面標志物的實驗研究

吳立勝1，魯 旭1，耿小平2，盧 寅1，張俊松1

目的 觀察人肝癌細胞株SMMC-7721中膜抗原CD133、CD105的表達情況并對不同亞群的生物學性狀進行體內(nèi)外實驗研究。方法以含10%胎牛血清的DMEM對SMMC-7721株細胞培養(yǎng)；采用流式細胞儀方法分選檢測CD133、CD105在SMMC-7721中表達情況并分選出CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋、CD133－／CD105－4個亞群；CCK-8和Transwell侵襲實驗分別檢測4個亞群和未分選細胞組的增殖及侵襲能力，軟瓊脂克隆實驗檢測5組細胞成球能力；裸鼠成瘤實驗了解CD133＋／CD105＋CD133－／CD105－亞群和未分選組的成瘤能力。結(jié)果流式細胞儀分選的CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋、CD133－／CD105－4種細胞亞群的比例分別為1.61%、0.01%、97.88%和0.50%。CD133＋亞群的增殖和成球能力較CD133－亞群及未分選細胞組強，而CD105＋亞群侵襲能力較CD105－亞群及未分選細胞組強。CD133＋／CD105＋組與CD133－／CD105－組及未分選細胞組相比成瘤所需的時間短、所需細胞數(shù)少、成瘤的體積大。結(jié)論 CD133在人肝癌細胞株SMMC-7721中的表達與其增殖成球能力有關，CD105與其侵襲能力有關，CD133＋／CD105＋具有體內(nèi)高度的成瘤能力。CD133＋／CD105＋亞群在人原發(fā)性肝癌細胞株SMMC-7721中具有腫瘤干細胞特性。

CD133；CD105；原發(fā)性肝癌；干細胞

腫瘤干細胞也稱作腫瘤起始細胞，目前尚無確切的定義，一般認為是一種罕見的具有自我更新、分、化多能性、腫瘤起始和對放化療抵抗等特性的腫瘤細胞亞群。隨著腫瘤干細胞學說的提出和深入研究，原發(fā)性肝癌腫瘤干細胞的存在也得到了越來越多的證實［1－4］，但目前發(fā)現(xiàn)的不同類型表面標志物是否能夠真正代表具有相應的腫瘤生物學特性尚不清楚，如何判斷和檢測人肝癌干細胞表面標志物仍處于探討研究狀態(tài)。該研究旨在通過體內(nèi)外實驗對經(jīng)流式細胞儀分選后的原發(fā)性肝癌細胞株SMMC-7721不同亞群進行分析研究，了解CD133聯(lián)合CD105表達在人原發(fā)性肝癌細胞株SMMC-7721中的腫瘤干細胞特性情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞株和實驗動物 人肝癌細胞株SMMC-7721由安徽醫(yī)科大學藥理教研室惠贈；SPF級雄性免疫缺陷裸小鼠（BALB／c裸鼠），4周齡，18～20 g，購自上海市斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.2主要試劑與儀器 CD133／（AC133）-PE抗體（德國Miltenyi公司）；APC Mouse Anti-Human CD105、Matrigel膠、流式細胞分選儀（美國BD公司）；細胞培養(yǎng)瓶、Transwell小室（美國Corning公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Hyclone公司）；CCK-8細胞增殖試劑盒（中國貝博公司）；低溫冰箱（－80℃、－20℃）、4℃冰箱（中國美菱公司）；超凈臺（中國蘇州凈化公司）；酶標儀、恒溫水育箱（美國Thermo公司）；離心機（美國CDK公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及傳代 用DMEM高糖培養(yǎng)基對肝癌細胞株SMMC-7721細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入10%胎牛血清、含濃度為100 U／L的青霉素、100 mg／ml的鏈霉素和2 mmol／L的谷氨酰胺，細胞培養(yǎng)瓶置入5%CO2、飽和濕度的恒溫（37℃）培養(yǎng)箱，細胞換液2 d 1次，同時觀察細胞生長情況，待細胞長滿培養(yǎng)瓶底面積約80%～90%時則需要細胞傳代，一般需要4～5 d。

1.2.2表型分析及流式細胞術分選 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞用胰蛋白酶消化1.5 min，PBS液洗滌后制成單細胞懸并精確計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5×106個／ml。取4只流式管，分別標記為A、B、C、D，其中A、B和C管分別加入100 μl制備好的單細胞懸液，D管加入1 ml單細胞懸液，再分別向A管中加入5 μl抗CD105的抗體，B管中加入5 μl抗 CD133的抗體，C管中加入25 μl抗CD105抗體和50 μl抗CD133的2種抗體，D管中則不加任何抗體；置入培養(yǎng)箱中孵育15 min；按D、A、B、C的順次上流式細胞分選儀，分析人肝癌細胞株SMMC-7721單細胞懸液中的CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋和CD133－／CD105－各細胞亞群的比例情況。

1.2.3體外增殖能力檢測 將已調(diào)整好細胞密度1×103個／ml的分選后人肝癌細胞株SMMC-7721的亞群細胞按CD133＋／CD105＋、CD133＋／CD105－、CD133－／CD105＋、CD133－／CD105－和未分選細胞順序標識為5組，再分別將各組細胞以200 μl／孔接種至96孔板中，其中每組均設置3個平行孔，共接種5板；接種完畢的96孔培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于每日上午約10點取1板避光條件下加入20 μl CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育1 h后酶標儀在450 nm波長處測各亞群細胞的光密度（optical density，OD）值。

1.2.4克隆生長能力檢測 取1.2%低熔點瓊脂糖10 ml與等體積的2×DMEM充分混勻，以混合液1 ml／孔鋪至24孔板底層（冰上操作）制備底層瓊脂膠并冷凝成膠凍狀；調(diào)整細胞密度，用2×DMEM培養(yǎng)基對經(jīng)流式細胞術分選后培養(yǎng)的SMMC-7721細胞4種亞群和未經(jīng)流式分選的細胞進行計數(shù)調(diào)整，使各組細胞密度為2×102個／ml；取0.7%低熔點瓊脂糖與2×DMEM等比例混合液1 ml鋪至24孔板底層（在冰上操作）制備頂層瓊脂膠并冷凝成膠凍狀，每組均設置3個平行實驗孔；置24孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，計算每組軟瓊脂凝膠中大于50個細胞的克隆數(shù)，分別計算，取得平均值及標準差。

1.2.5Transwell小室侵襲實驗 按購買的Transwell小室說明書進行人工基底膜的制備。用無血清DEME培養(yǎng)基將已分選獲得的各SMMC-7721亞群和未分選細胞制成單細胞懸液，再計數(shù)調(diào)整細胞密度為5×105個／ml濃度。在已制備好的上室各孔加入100 μl細胞，每組細胞設置3個平行孔（冰上操作），下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2溫箱中孵育24 h以上后取出上室，吸盡上室內(nèi)的培養(yǎng)基，用棉簽擦去聚碳酸酯膜上表面的細胞，然后將小室置于2%多聚甲醛中固定15 min，再用蘇木精－伊紅染液染色2 min，PBS洗滌后隨機選擇5個視野，于200倍光鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)，計算均值及標準差。每組試驗重復3次。

1.2.6裸鼠皮下接種移植瘤 雄性免疫缺陷裸小鼠18只（BALB／c裸鼠），在SPF級動物實驗室經(jīng)過2個階段1周的飼養(yǎng)，過度到無特殊病原體的飼養(yǎng)標準。按隨機數(shù)字表然后將18只裸鼠隨機分為3組，每組6只，選取將經(jīng)過流式細胞儀分選得到CD105＋／CD133＋、CD105－／CD133－亞群細胞和未分選細胞3組細胞重懸于無血清的DMEM中，調(diào)整各組細胞懸液濃度為目標濃度后再接種到裸鼠背部皮下。每只裸鼠注入0.2 ml，繼續(xù)飼養(yǎng)，從接種時間算起，每2周觀察和測量每只裸鼠的移植瘤的情況，記錄有無移植瘤和移植瘤的體積大??；對于接種約1個月沒有明顯腫瘤形成的小鼠，再接種較高濃度的細胞懸液至腫瘤形成。典型的成瘤實驗結(jié)果拍照紀錄。所有的成瘤實驗于接種3個月后終止，將18只BALB／c裸鼠按頸椎脫臼法處死，手術完整剝離裸鼠移植瘤，游標卡尺逐個測量移植瘤的長徑（a）、短徑（b），計算移植瘤體積。移植瘤體積（mm3）＝（a×b2）÷2。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。細胞克隆能力、生長能力、侵襲能力的比較采用單因素方差分析方法，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，體內(nèi)實驗移植瘤體積比較采用配對樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CD133、CD105在SMMC-7721細胞株中流式細胞儀分選流式細胞儀表型測定檢測顯示人肝癌細胞株SMMC-7721細胞CD105＋／CD133＋、CD105－／CD133＋、CD105＋／CD133－、CD105－／CD133－亞群的比例分別為1.61%、0.01%、97.88%和0.50%。見圖1。單獨以CD133＋標識肝癌SMMC-7721細胞的比

例為1.62%，而CD105＋的流式分選結(jié)果為99.49%。

2.2 人肝癌細胞株SMMC-7721各亞群及未分選細胞的增殖能力檢測采用CCK-8檢測分選獲得的4種SMMC-7721細胞亞群及未分選細胞。結(jié)果顯示，在細胞接種于96孔板后的第一個24 h，各組細胞的數(shù)目（以OD450表示）的差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.059）；而48 h以后各組細胞的數(shù)量的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。此外，通過分析可知CD133＋細胞亞群（包括CD105＋／CD133＋和CD105－／CD133＋）的數(shù)量多于CD133－的細胞亞群及未分選細胞；而兩種CD133＋亞群及兩種CD133－亞群之間細胞數(shù)量的差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

2.3 軟瓊脂克隆培養(yǎng)實驗軟瓊脂克隆培養(yǎng)14 d后，計數(shù)4種細胞亞群及未分選細胞的克隆數(shù)分別為（50.3±7.4）、（35.0±3.5）、（25.3±1.5）、（11.3 ±2.1）和（18.0±2.6），各組間克隆數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義（F＝3 938.213，P＜0.05）。其中，CD133＋／CD105＋與CD133＋／CD105－形成的克隆數(shù)之間差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.06），CD133－／CD105＋和CD133－／CD105－之間差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.315）。見圖3。

2.4 Transwell小室侵襲實驗Transwell小室在常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h，固定、染色聚碳酸酯膜下表面的細胞。計數(shù)CD133＋／CD105＋、CD133－／CD105＋、未分選細胞、CD133＋／CD105－和CD105－／CD133－細胞組的跨膜細胞數(shù)分別為（109.3±1.15）、（96.7± 3.79）、（80.0±1.00）、（33.3±1.53）、（28.3± 1.15），各組間細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義（F＝1 002.852，P＝0.029）。進一步分層分析，兩組CD105＋細胞亞群之間的跨膜細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.045）；而兩組CD105－的細胞亞群之間差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.285）。見圖4。

2.5 動物實驗

2.5.1 觀察裸鼠皮下移植瘤 所有的成瘤實驗于接種3個月后終止，飼養(yǎng)及實驗過程中無裸鼠死亡，將18只BALB／c裸鼠按頸椎脫臼法處死，手術完整剝離裸鼠皮下移植瘤。實驗過程中觀察到1 000個CD133＋／CD105＋細胞在第1個月就能在2只（本組共6只）裸鼠內(nèi)產(chǎn)生腫瘤，而注射同樣細胞數(shù)的CD133－／CD105－亞群和未分選組則未能觀察到腫瘤產(chǎn)生；然后調(diào)整細胞數(shù)量至3 000個細胞數(shù)進行各組注射，結(jié)果提示，CD133＋／CD105＋亞群在第3個月6只均有腫瘤生成，而未分選組則有4只有腫瘤生成，CD133－／CD105－亞群在第3個月僅3只有腫瘤生成。實驗結(jié)果表明，分選后的CD133＋／CD105＋亞群裸鼠的皮下移植瘤生長具有明顯性，而分選后的CD133－／CD105－亞群和未分選組裸鼠的皮下移植瘤生長明顯緩慢。見圖5、6。

2.5.2測量裸鼠皮下移植瘤 終止實驗后，手術完整剝除各組皮下移植瘤，游標卡尺測量各組的長、短徑并按公式計算出裸鼠移植瘤體積。結(jié)果顯示CD133＋／CD105＋亞群裸鼠皮下移植瘤體積為（1.652±0.014）mm3，CD133－／CD105－亞群裸鼠皮下移植瘤體積為（0.807±0.053）mm3，未分選組裸鼠的皮下移植瘤體積為（0.831±0.069）mm3；CD133＋／CD105＋亞群和CD133－／CD105－亞群及未分選組裸鼠的皮下移植瘤體積比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而CD133－／CD105－亞群與未分選組裸鼠的皮下移植瘤體積比較差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

近年來腫瘤干細胞學說的研究不斷深入，但仍然缺乏對腫瘤干細胞精確分子標志物的了解。迄今為止，雖已有多種假定腫瘤干細胞相關標志物被鑒定，但相關標志物也并非特異性表達在大多數(shù)相應的腫瘤細胞中［5］；原發(fā)性肝癌的腫瘤干細胞表面標志物的研究也處于探討狀態(tài)。過去幾年間，CD133作為原發(fā)性肝癌表面標志物被廣泛關注，但CD133不能作為原發(fā)性肝癌的表面標志物的特異性標記［6］。目前對于腫瘤干細胞標志物的研究多集中于膜表面抗原的聯(lián)合檢測，如檢測急性髓細胞白血病的CD34＋／CD38－［7］、檢測胰腺癌的ESA＋CD44＋CD24＋［8］。在此實驗中也采用膜抗原的聯(lián)合檢測方法。研究［9－10］顯示CD105更適合作為人原發(fā)性肝癌中血管生成的特殊標志物。前期的體外實驗研究［11］探討了CD133＋／CD105＋在HepG2細胞株中的腫瘤干細胞特性。有學者認為HepG2細胞株來自于肝母細胞瘤，在HepG2細胞株的體外實驗結(jié)果并不能完整驗證CD133＋／CD105＋細胞亞群在肝癌中的腫瘤干細胞特性，SMMC-7721肝癌細胞株有貼壁性強，且容易形成體內(nèi)實驗轉(zhuǎn)移瘤等特點，因此選擇SMMC-7721肝癌細胞株進行相關實驗。

流式細胞術分選結(jié)果表明SMMC-7721細胞膜表面CD133＋／CD105＋的比例為1.61%。生長曲線顯示CD133＋細胞亞群的生長速度明顯快于CD133－細胞亞群及未分選細胞，CCK-8增殖試驗結(jié)果顯示CD133＋細胞亞群的OD450值為CD133－細胞亞群的1.5倍。通過軟瓊脂克隆培養(yǎng)試驗，2周后CD133＋細胞亞群的克隆數(shù)量為CD133－細胞亞群4.55倍，同樣證明了CD133＋細胞亞群的生長速度快于CD133－細胞亞群。在細胞增殖實驗中細胞膜抗原CD105對人原發(fā)性肝癌細胞株SMMC-7721增殖無明顯影響，而細胞膜抗原CD133主要誘發(fā)或主導細胞增殖加強?？寺嶒灡砻魅嗽l(fā)性肝癌細胞株SMMC-7721的成瘤活性與膜抗原CD133密切相關。Transwell小室侵襲實驗顯示CD105＋細胞亞群穿膜細胞數(shù)是CD105－細胞亞群2倍余；進一步分層分析可知，兩組CD105－的細胞亞群之間的跨膜細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義，而兩組CD105＋細胞亞群之間則差異有統(tǒng)計學意義；提示人原發(fā)性肝癌細胞株SMMC-7721侵襲能力與CD105密切相關，而CD133對其侵襲能力的作用影響有限。

驗證腫瘤干細胞最具有說服力的實驗是其體內(nèi)的成瘤能力［12］，CD133＋／CD105＋細胞亞群在1 000個細胞數(shù)和第1個月即能在裸鼠身上能明顯成瘤，較CD133－／CD105－和未分選組速度明顯增快，CD133＋／CD105＋亞群組的體內(nèi)成瘤率高，成瘤體積大，所需細胞數(shù)少。實驗結(jié)果表明，分選后的CD133＋／CD105＋亞群裸鼠的皮下移植瘤生長具有明顯性，而分選后CD133－／CD105－亞群和未分選組裸鼠的皮下移植瘤生長明顯緩慢。成瘤實驗的結(jié)果證明CD133＋／CD105＋亞群組的體內(nèi)成瘤能力明顯增強。

綜上所述，本研究通過體外的增殖能力、侵襲能力實驗和體內(nèi)裸鼠成瘤實驗，證實CD133＋／CD105＋細胞亞群的增殖能力、侵襲能力、自我更新能力及致瘤能力均強于其他亞群，說明CD133＋／CD105＋細胞亞群含有更多干細胞樣特性的腫瘤細胞，即在SMMC-7721細胞株中，CD133＋／CD105＋更能夠精確鑒定肝癌干細胞特性。綜合前期在人肝細胞株HepG2中的研究結(jié)果，本研究提示CD133＋／CD105＋亞群更能代表人肝癌腫瘤生物學特性的原始細胞。

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CD105／CD133 as cell surface markers for screening and identification of stem cell in SMMC-7721

Wu Lisheng1，Lu Xu1，Geng Xiaoping2，et al
（1Dept of Invasive Surgery，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230061；2Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveThe objective of this research is to compare the expression of CD105 and CD133 in membrane of human HCC cell line SMMC-7721，different biological characters among the subpopulations in vitro and vivo.MethodsSMMC-7721 cell line was cultured in DMEM containing 10%FBS.Flow cytometry was used to detect CD105，CD133 expression in SMMC-7721 cell in vitro.Four cell sub-populationsCD133＋／CD105＋，CD133＋／CD105－，CD133－／CD105＋，CD133－／CD105－were sorted by flow cytometry.Cell proliferation of these four subpopulations was detected by CCK-8 assay.Sphere formation ability of these four sub-populations was examined by soft agar test.Invasion ability of these four sub-populations was examined by Transwell cell invasion test.In vivo tumorigenicity assay was also performed on these four sub-populations using nude mice.ResultsThe proportions of four sub-populations CD133＋／CD105＋，CD133＋／CD105－，CD133－／CD105＋，CD133－／CD105－were 1.61%，0.01%，97.88%and 0.50%sorted by flow cytometry，respectively.CD133＋subsets cells grew more quickly than those of CD105＋and unsorted cells.The numbers of colonies formed by CD133＋subsets cells were more than those of CD105＋and unsorted cells.Furthermore，the metastatic capacity of CD105＋subset cells observed by Transwell assay was higher than that of the CD133＋subsets cells and unsorted cells.In vivo tumor experiments showed CD133＋／CD105＋needed a shorter time and fewer cells，compared with unsorted group and CD105－CD133－groups were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionOur study finds that human live cancer cell line SMMC-7721 can be sorted into four sub-groups CD133＋／CD105＋，CD133＋／CD105－，CD133－／CD105＋and CD133－／CD105－successful by flow cytometry.It is found that CD133＋／CD105＋sub-group shows high proliferative potential，high capacity for self-renewal by proliferation assay，clone forming assay and in vitro invasion assay.In vivo tumor experiment proves CD133＋／CD105＋sub-group shows a higher degree of tumorigenicity.Therefore，CD133＋／CD105＋subset cells are a subpopulation with stem properties in SMMC-7721 cells.

CD133；CD105；primary hepatocellular carcinoma；stem cell

R 735.7

1000－1492（2015）02－0158－06

2014－11－04接收

安徽省科技攻關計劃（編號：1301zc04065）；合肥市科技局［編號：2013（26）］

1安徽醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（合肥市第一人民醫(yī)院）微創(chuàng)外科，合肥 2300612安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝臟外科，合肥 230022作者簡介：吳立勝，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導師；耿小平，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：xp-geng＠163.net