呼吸道肺炎克雷伯菌耐藥性與CTX-M型ESBLs的研究*

鐘如柱,許志明，喻云梅，劉 軍，趙祖國

(1.廣東省廉江市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 524400；2.廣東醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，廣東湛江 524023)

論著·臨床研究

呼吸道肺炎克雷伯菌耐藥性與CTX-M型ESBLs的研究*

鐘如柱1,許志明1，喻云梅2，劉 軍2，趙祖國2

(1.廣東省廉江市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 524400；2.廣東醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，廣東湛江 524023)

目的探討來源于呼吸道肺炎克雷伯菌(KP)耐藥性與CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的關(guān)系。方法采用PCR擴增和測序分析檢測KP質(zhì)粒和染色體上的CTX-M型ESBLs基因；采用紙片擴散法檢測抗菌藥物敏感性；使用χ2檢驗分析相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果有CTX-M-1群酶和CTX-M-25群酶檢出，CTX-M型ESBLs的總檢出率為39.02%(48株)，其中質(zhì)粒和染色體上同時攜帶CTX-M-1群酶的檢出率為26.02%(32株)。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物頭孢唑林、氟喹諾酮類抗菌藥物左旋氧氟沙星、磺胺類抗菌藥物復(fù)方磺胺甲惡唑等在CTX-M型ESBLs陽性組的耐藥率明顯高于陰性組(P<0.05)。結(jié)論在來源于呼吸道的KP中，在質(zhì)粒和染色體上同時攜帶CTX-M-1群酶基因最常見，CTX-M型ESBLs與KP對某些抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性關(guān)系密切。

呼吸道感染；肺炎克雷伯菌；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是引起呼吸道感染常見的革蘭陰性桿菌，根據(jù)全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計，KP的檢出率在腸桿菌科細菌中排列第2，僅次于大腸埃希菌，其對多種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥[1]。非透射電鏡(TEM)型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和非SHV 型ESBLs起源的CTX-M型ESBLs，是我國目前最常見、最主要的ESBLs，常見的亞群有CTX-M-1 群、CTX-M-2 群、CTX-M-8群、CTX-M-9群和CTX-M-25群，是造成KP對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的重要原因[2-3]。值得的注意的是，CTX-M型ESBLs在各地區(qū)的攜帶率、種類、位置等均不一致，為了解本地區(qū)引起呼吸道感染的KP的耐藥性與CTX-M型ESBLs的關(guān)系，本研究通過檢測CTX-M型ESBLs在來源于呼吸道KP質(zhì)粒和染色體上的流行現(xiàn)狀和KP的耐藥性，探討CTX-M型ESBLs與KP耐藥性的關(guān)系，為治療KP引起的呼吸道感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 123株非重復(fù)KP 來源于2013年10月至2014年10月廣東省廉江市人民醫(yī)院和廣東醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床送檢的痰標本，其中肺源性KP 54株；抗菌藥物敏感性試驗的質(zhì)控株大腸埃希菌ATCC25922和各類CTX-M型ESBLs陽性株均由廣東醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 染色體和質(zhì)粒DNA的制備 采用ESBLs檢測試劑盒檢測KP的產(chǎn)ESBLs情況，試劑盒購自杭州天和微生物試劑公司。參考文獻[4]，采用變溫十二烷基硫酸鈉(SDS)消除法消除產(chǎn)ESBLs株的質(zhì)粒后(確認消除效果：質(zhì)粒抽提，電泳檢測消除結(jié)果)，采用基因組提取試劑盒提取細菌染色體DNA，質(zhì)粒DNA直接采用質(zhì)粒提取試劑盒提取，試劑盒均購自大連寶生物有限公司，并用核酸蛋白檢測儀(BECHMA，DU730)檢

表1 用于擴增CTX-M型ESBLs基因的引物

1.2.2 CTX-M基因的檢測 根據(jù)GenBank中的所提供的序列，運用oligo及premier5.0軟件設(shè)計各類CTX-M型ESBLs的特異引物，并由上海生工合成。分別以質(zhì)粒DNA和染色體DNA為模板，PCR檢測質(zhì)粒和染色體上的各類CTX-M型ESBLs基因，PCR試劑盒購自大連寶生物有限公司。引物序列等情況見表1。

1.2.3 TA克隆、轉(zhuǎn)化及DNA系列分析 挑選目的PCR產(chǎn)物，采用PCR產(chǎn)物快速回收試劑盒(大連寶生物有限公司)純化PCR產(chǎn)物，隨后采用超級感受態(tài)細菌制備試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)進行制備感受態(tài)細菌(DH5α大腸埃希菌)。載體為PMDTM18-T載體(大連寶生物有限公司)，嚴格按照相關(guān)試劑盒說明書操作，并把菌液送上海生工測序。利用 Chromas軟件，把所測的結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫進行比對分析，以確定耐藥基因類型。

1.2.4 抗菌藥物敏感性試驗 采用紙片擴散法測定123株KP對14種臨床常用抗菌藥物的敏感性。試驗結(jié)果判斷參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)的標準[5]，各種抗菌藥物紙片等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗分析相關(guān)數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTX-M型ESBLs基因的檢測結(jié)果 產(chǎn)ESBLs株共57株(46.34%)，CTX-M型ESBLs基因的檢出率為39.02%(48株)，占ESBLs陽性的84.21%(48/57)，其中CTX-M-1型ESBLs的檢出率為38.21%(47株)，CTX-M-25型ESBLs的檢出率為3.25%(4株)，CTX-M-2型ESBLs基因、CTX-M-8型ESBLs基因、CTX-M-9型ESBLs基因的檢出率均為0?；虼嬖诘奈恢梅謩e為僅在質(zhì)粒上、僅在染色體上、同時在質(zhì)粒和染色體上。通過χ2分析可知，肺源性KP與非肺源性KP之間的基因檢出率、基因類型、基因位置、耐藥性的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1、圖2。

2.2 抗菌藥物敏感性試驗 根據(jù)CTX-M型ESBLs的檢出情況和是否是肺源性KP進行分組，第1組為CTX-M型ESBLs陽性組(n=48)，第2組為CTX-M型ESBLs陰性組(n=75)，第3組為肺源性KP組(n=54)，第4組為非肺源性KP組(n=69)。耐藥結(jié)果見表3。

表2 肺源性KP與非肺源性KP的CTX-M型ESBLs基因檢測情況[n(%)]

M：Marker(100～2 000 bp)；1：陽性對照；2：陰性對照；3～12：實驗菌株。

圖1 CTX-1型ESBLs基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

M：Marker(100～2 000 bp)；1：陽性對照；2：陰性對照；3～12：實驗菌株。

圖2 CTX-25型ESBLs基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

表3 123株KP對14種常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果[n(%)]

3 討 論

ESBLs在KP的檢出率(46.34%)較伊朗報道的59.20%低，較北京等報道的32.21%高，但CTX-M型ESBLs基因占ESBLs的比率(84.21%)卻高于伊朗的23.90%，而與北京等地的84.80%相近[6-7]。流行的CTX-M型ESBLs以CTX-M-1群酶為主(38.21%)，這與我國湖北、印度南部相同[8-9]，而不同于巴西累西腓市是以CTX-M-2群酶為主[10]。本地區(qū)只有CTX-M-1群酶和CTX-M-25群酶，但在巴西卻可檢測出CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8和 CTX-M-9群酶[11]，提示在呼吸道來源的KP中，其產(chǎn)ESBLs、攜帶CTX-M型ESBLs基因的情況均有地區(qū)差異性，這可能與各地區(qū)使用抗菌藥物習(xí)慣或檢測方法等不同有關(guān)。鑒于各類型CTX-M型ESBLs在KP中造成耐藥程度等不同[12]，為了更好掌握來源于呼吸道KP的耐藥形勢，應(yīng)加強CTX-M型ESBLs的檢測和研究。

CTX-M 型 ESBLs 基因既可以位于質(zhì)粒上又可以位于染色體上[13]。表2顯示，KP上CTX-M型ESBLs基因的位置有3處：一處位于染色體上，二處位于質(zhì)粒上，三處在染色體和質(zhì)粒同時存在，并且以同時存在于質(zhì)粒和染色體上最為常見，其中CTX-M-1同時存在于質(zhì)粒和染色體上的菌株占CTX-M型ESBLs陽性株的72.92%[(14+18+2+1)/48]，這為CTX-M-1型ESBLs的播散提供便利的條件。突尼斯曾經(jīng)出現(xiàn)位于質(zhì)?；蛉旧w上的CTX-M型ESBLs在可移動遺傳因子ISEcpI的作用下，使CTX-M型ESBLs基因在質(zhì)粒與質(zhì)粒中、質(zhì)粒與染色體中、染色體與質(zhì)粒中播散開來[14]。CTX-M-25群酶基因則主要存在染色體上，這與以色列存在于質(zhì)粒上不同[15]。值得注意的是，CTX-M-1群酶和CTX-M-25群酶同時存在于一株KP的菌株已出現(xiàn)。提示隨著抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，以及抗菌藥物在畜牧業(yè)上應(yīng)用日益頻繁，細菌攜帶的耐藥基因種類將會越來越多。臨床應(yīng)加強檢測，防止耐藥菌傳播。

多種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(如頭孢唑林、頭孢他啶等)在CTX-M型ESBLs陽性組的耐藥率明顯高于CTX-M型ESBLs陰性組(P<0.05)，提示KP對某些β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥性與CTX-M型ESBLs關(guān)系密切，但頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦等在CTX-M型ESBLs陽性組與陰性組間的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能與第4代頭孢菌素類抗菌藥物對β-內(nèi)酰胺酶比較穩(wěn)定、CTX-M型ESBLs可以被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制有關(guān)[16]。目前KP往往同時攜帶多種耐藥基因，其耐藥表型是幾種耐藥機制共同作用的結(jié)果，這可能也是原因之一[11,17]。CTX-M型ESBLs最主要的特征就是大部分CTX-M 型 ESBLs(除CTX-M-6、CTX-M-15和CTX-M-19外)對頭孢噻肟的水解力高于頭孢他啶，但在西班牙發(fā)現(xiàn)，一些CTX-M型ESBLs突變體水解頭孢他啶的能力和水解頭孢噻肟的能力一樣強，CTX-M-1型酶突變體的這種變化最明顯[18]，表3顯示，頭孢他啶和頭孢噻肟的耐藥率相差明顯，提示本地區(qū)的CTX-M-1并未突變，但也應(yīng)注意這方面的動向。

值得注意的是，喹諾酮類抗菌藥物左旋氧氟沙星和磺胺類抗菌藥物復(fù)方磺胺甲惡唑在CTX-M型ESBLs陽性組的耐藥率也明顯高于陰性組(P<0.05)，這可能與攜帶CTX-M型ESBLs陽性株經(jīng)常同時攜帶抗喹諾酮類抗菌藥物基因和抗磺胺類抗菌藥物基因有關(guān)[17]。值得一提的是，通過χ2分析可知，肺源性KP與非肺源性KP之間的基因檢出率、基因類型、基因位置、耐藥性的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，在呼吸道來源的KP中，其攜帶CTX-M型ESBLs基因常見，而且位置多樣化，并以KP耐藥性關(guān)系密切。為了更好治療KP引起的呼吸道感染，應(yīng)重視CTX-M型ESBLs的研究和檢測。

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Study on the resistance of klebsiella pneumoniae which come from respiratory tract and CTX-M ESBLs*

ZhongRuzhu1，XuZhiming1，YuYunmei2，LiuJun2,ZhaoZuguo2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine，thePeople′sHospitalofLianjiang,Lianjiang，Guangdong524400，China; 2.LaboratoryofPathogenBiology，GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang，Guangdong524023，China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the resistance of klebsiella pneumoniae(KP) which come from respiratory tract and CTX-M extended spectrum β-lactamase(ESBLs).MethodsDetecting CTX-M ESBLs genes in the plasmid and chromosomes were used by PCR and sequence analysis;Disk diffusion method was sued by antibiotics susceptibility test;Chi square test was sued by analytic the data.ResultsCTX-M-1 ESBLs and CTX-M-25 ESBLs were detected in the KP and the total detection rate of CTX-M ESBLs was 39.02%(48 strains)，the detection rate of CTX-M-1 ESBLs was 26.02%(32 strains) which existence in the plasmid and chromosomes simultaneously.The resistance rate of β-lactam antibiotic cefazolin，fluoroquinolone antibiotic levofloxacin and sulfonamides antibiotic bactrim and so on in positive group of CTX-M ESBLs were significantly higher than negative group of CTX-M ESBLs(P<0.05).ConclusionCTX-M-1 ESBLs gene which concurrent in the plasmid and chromosomes may the most common.KP resistance to certain antibiotics closely is relate to the CTX-M ESBLs.

respiratory tract infections；klebsiella pneumoniae;extended spectrum β-lactamase

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.008

國家自然科學(xué)基金資助項目(81301473)；湛江市財政資金科技專項(2013A01007)；湛江市科技攻關(guān)項目(2014BO1184)；湛江市科技攻關(guān)計劃(2012C3106022)；廣東醫(yī)學(xué)院面上項目(M2012005)。

：鐘如柱(1981-)，本科，主治醫(yī)師，主要從事呼吸道病原菌的耐藥機制研究。

R446

A

1671-8348(2015)27-3768-04

2015-03-08

2015-05-10)