SALL4基因在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義*

郭 勇，唐永梁，楊俊濤，張 鑫，劉 蕾

(1.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院普外科 401220；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所肝膽外科，重慶 400042；3.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所普通外科，重慶400042；4第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，重慶400038)

論著·臨床研究

SALL4基因在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義*

郭 勇1，唐永梁2，楊俊濤2，張 鑫3，劉 蕾4

(1.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院普外科 401220；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所肝膽外科，重慶 400042；3.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所普通外科，重慶400042；4第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，重慶400038)

目的檢測(cè)人類(lèi)婆羅雙樹(shù)樣基因-4(SALL4)在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系。方法采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Westrrn blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)91例胃癌組織和37例正常胃黏膜中SALL4的表達(dá)，分析SALL4與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果SALL4在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為74.7%，顯著高于正常胃黏膜組織陽(yáng)性表達(dá)率18.9%(P<0.05)，而且隨著胃癌分化程度的降低，SALL4的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度逐漸增高；胃癌組織SALL4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在胃癌組織中SALL4的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)、分化程度(P=0.029)和浸潤(rùn)深度(P=0.050)密切相關(guān)。結(jié)論SALL4基因在胃癌組織中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。

胃腫瘤；免疫組織化學(xué)；SALL4

胃癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，居全球腫瘤發(fā)病率的第4位，居我國(guó)發(fā)病率第2位[1-2]。胃癌早期無(wú)明顯癥狀，大部分患者在診斷時(shí)已是晚期，錯(cuò)失最佳的治療時(shí)機(jī)。因此，尋找胃癌新的腫瘤標(biāo)記物，具有重要的科學(xué)意義和醫(yī)學(xué)價(jià)值。人類(lèi)婆羅雙樹(shù)樣基因-4(SALL4)是一種新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，多項(xiàng)研究表明，SALL4不僅是胚胎干細(xì)胞的特異標(biāo)記物，而且在乳腺癌、前列腺癌、急性髓性白血病等多種腫瘤中均有表達(dá)[3-5]。目前，國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于SALL4在胃癌中的相關(guān)研究。本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Western blot和免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)SALL4基因和蛋白在胃癌中的表達(dá)情況，并闡明其和臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所普通外科2011～2013年手術(shù)切除胃癌標(biāo)本91例，其中，男62例，女29例，平均年齡52歲。腫瘤直徑大于5 cm 56例，小于或等于5 cm 35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 61例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移23例；癌旁組織37例，取自胃癌手術(shù)切端正常組織。本研究所有病例均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，術(shù)前未接受過(guò)化學(xué)治療及放射治療，并經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得患者的知情同意。

1.2 儀器與試劑 全封閉脫水機(jī)(德國(guó)Leica 1010)，全自動(dòng)切片機(jī)(德國(guó) Leicarm 2245)，全自動(dòng)染色機(jī)(Leicaauto Stainer XL)，顯微機(jī)(日本Olympus pm-20)及Olympus pm-C35DX成像系統(tǒng)。LightCycler定量PCR擴(kuò)增儀(瑞士Roche)，Tanon凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能)。TaKaRa RNAiso試劑，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒，DNA Marker，逆轉(zhuǎn)錄試劑和PCR試劑(北京中杉)，SALL4 兔抗人多克隆抗體(Abcam)。其他試劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法 SALL4檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)SP法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。采用德國(guó)IECIA圖像分析儀進(jìn)行圖像分析，SALL4免疫陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞核，呈棕色顆粒樣。半定量判定：根據(jù)染色強(qiáng)度，依次為無(wú)色(0分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)；染色范圍(染色細(xì)胞所占的百分比)：陽(yáng)性細(xì)胞小于5%(0分)，5%～25%(1分)，>25%～50%(2分)，>51%～75%(3分)，>75%(4分)。最后按染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞之積為免疫組織化學(xué)的結(jié)果，<2分為(-)，2～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)。

1.3.2 RT-PCR 取100 mg胃癌組織，采用Trizol法提取總RNA，以RNA為模板，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 s。引物由碧云天公司合成，SALL4引物序列為：5′-TCG ATG GCC AAC TTC CTT C-3′，5′-GAG CGG ACT CAC ACT GGA GA-3′，PCR產(chǎn)物為142 bp。以β-actin為內(nèi)參，循環(huán)擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，SALL4(61 ℃)/β-actin(55 ℃)，退火30 s,72 ℃延伸30 s，38個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠圖像掃描系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行吸光度(A)檢測(cè)，計(jì)算出SALL4與β-actin的A比值，結(jié)果以SALI4/β-actin表示。

1.3.3 Western blot 組織勻漿后，加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，冰上裂解40 min。4 ℃，12 000 r/min離心10 min，將上清液移至新管，采用BCA法測(cè)蛋白濃度。分別配制10% 分離膠與5%濃縮膠，每孔上樣30 μg，恒壓電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。將目的條帶孵育在β-actin和SALL4一抗中4 ℃過(guò)夜。次日室溫孵育二抗1 h，曝光檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 SALL4 免疫組織化學(xué)結(jié)果 在胃癌組織中，SALL4表達(dá)較強(qiáng)，主要定位于細(xì)胞核，呈棕色顆粒樣；在正常胃黏膜組織中SALL4表達(dá)較弱，棕色顆粒較?。籗ALL4在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為74.7%(68/91)，顯著高于正常胃黏膜組織陽(yáng)性表達(dá)率18.9%(7/37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著胃癌分化程度的降低，SALL4的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度逐漸增高。見(jiàn)圖1。

表1 胃癌組織中SALL4 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表1 胃癌組織中SALL4 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

A:正常胃黏膜;B:胃高分化腺癌;C:胃低分化腺癌;D:SALL4組化評(píng)分。*：P<0.05，與正常胃黏膜比較。

圖1 SALL4在正常胃黏膜、胃高分化腺癌和胃低分化腺癌中的表達(dá)

A：SALL4 mRNA比較;B：SALL4蛋白比較，T:腫瘤組織;N:正常胃黏膜組織。

圖2 SALL4在正常胃黏膜和胃癌中mRNA和蛋白的表達(dá)水平

2.2 SALL4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平 RT-PCR結(jié)果表明SALL4位于142 bp，胃癌組織中條帶亮度顯著高于正常胃黏膜組織，見(jiàn)圖2；灰度掃描結(jié)果顯示，胃癌組織SALL4 mRNA(3.15±0.42) 表達(dá)水平高于正常胃黏膜組織(0.27±0.08)(P<0.05)。Western blot結(jié)果同樣表明，胃癌組織中SALL4 蛋白的表達(dá)量顯著高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 SALL4 與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SALL4在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)率為85.2%，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)率53.3%(P=0.001)；SALL4在中高分化組的表達(dá)率為67.2%，高于低分化組的表達(dá)率87.8%(P=0.029)；SALL4在浸潤(rùn)深度T1/T2組的表達(dá)率為62.9%，高于浸潤(rùn)深度T3/T4組表達(dá)率79.6%(P=0.050)；SALL4表達(dá)率與年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤大小等病理參數(shù)無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其中涉及癌基因(ras、c-myc、C-erb-2等)和抑癌基因(p21、p53等)的改變，上述基因表達(dá)的變化對(duì)胃癌的生物學(xué)行為和預(yù)后均有影響[6-8]。SALI4是一種新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，定位于人類(lèi)染色體20q13，屬于SALL基因家族成員，含有4個(gè)外顯子，為C2H2鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，編碼SALI4A和SALI4B兩種異構(gòu)體蛋白，表達(dá)于細(xì)胞核[9-10]。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，SALL4基因的表達(dá)可激活Wnt、Bmi-1和Pten等通路，在早期胚胎發(fā)育和維持胚胎干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用，而且SALL4在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中異常表達(dá)，可能與白血病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[4，11]。在具有干細(xì)胞特性的肝癌亞型中，SALL4 表達(dá)與預(yù)后差密切相關(guān)，基因表達(dá)分析顯示SALL4+肝癌細(xì)胞中，“干性”相關(guān)基因富集，提示SALL4 是具有侵襲表型的干/祖樣肝癌細(xì)胞的分子標(biāo)志[12]。在腸道腫瘤中，F(xiàn)orghanifard等[13]研究發(fā)現(xiàn)，SALL4 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)比正常組織高出2倍多，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示SALL4 可能是一個(gè)新的腫瘤轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志[13]。

本研究通過(guò)RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)SALL4在胃癌組織和正常胃黏膜組織中基因和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SALL4 mRNA和蛋白水平均顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SALL4在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為74.7%(68/91)，顯著高于正常胃黏膜組織陽(yáng)性表達(dá)率18.9%(7/37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著胃癌分化程度的降低，SALL4的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度逐漸增高，說(shuō)明SALL4可能與胃癌的分化程度相關(guān)。本研究中，SALL4的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度密切相關(guān)，與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)[4]。這與其他作者等在宮頸癌組織中的研究部分一致，張銘等[14]研究發(fā)現(xiàn)SALL4在宮頸癌組織中高表達(dá)，與宮頸癌的分化相關(guān)，SALL4的表達(dá)可能對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有重要作用。

綜上所述，SALL4在胃癌組織中表達(dá)增加，而且與胃癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SALL4的陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，檢測(cè)胃癌組織中SALL4蛋白的表達(dá)有助于胃癌的診斷及預(yù)后判斷，但其具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1]Peng JJ，Xiao P，Xu JB，et al.Clinicopathological features and trend changes of gastric carcinoma in Southern China[J].World J Gastroenterol，2014，20(15):4401-4406.

[2]Zhu X，Li J.Gastric carcinoma in China:Current status and future perspectives(Review)[J].Oncol Lett，2010，1(3):407-412.

[3]Yang J，Gao C，Chai L，et al.A novel SALL4/OCT4 transcriptional feedback network for pluripotency of embryonic stem cells[J].PLoS One，2010，5(5):e10766.

[4]Yang J，Chai L，F(xiàn)owles TC，et al.Genome-wide analysis reveals Sall4 to be a major regulator of pluripotency in murine-embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(50):19756-19761.

[5]Gao C，Kong NR，Chai L.The role of stem cell factor SALL4 in leukemogenesis[J].Crit Rev Oncog，2011，16(1/2):117-127.

[6]Lin Z，Zhang C，Zhang M，et al.Targeting cadherin-17 inactivates Ras/Raf/MEK/ERK signaling and inhibits cell proliferation in gastric cancer[J].PLoS One，2014，9(1):e85296.

[7]Liu X，Yu H，Cai H，et al.Expression of CD24，p21，p53，and c-myc in alpha-fetoprotein-producing gastric cancer:Correlation with clinicopathologic characteristics and survival[J].J Surg Oncol，2014，109(8):859-864.

[8]Sanaat Z，Halimi M，Ghojezadeh M，et al.Immunohistochemical analysis of p53，Ki-67，CD44，HER-2/neu expression patterns in gastric cancer，and their association with one year survival in North-West of Iran[J].Int J Hematol Oncol Stem Cell Res，2013，7(3):15-20.

[9]Firor AE，Jares A.Nuclear localization of SALL4:a stemness transcription factor[J].Cell Cycle，2014，13(10):1522-1523.

[10]Jones B.Liver cancer:SALL4——a cancer marker and target[J].Nat Rev Clin Oncol，2013，10(8):426.

[11]Lim CY，Tam WL，Zhang J，et al.Sall4 regulates distinct transcription circuitries in different blastocyst-derived stem cell lineages[J].Cell Stem Cell，2008，3(5):543-554.

[12]Yakaboski E，Jares A，Ma Y.Stem cell gene SALL4 in aggressive hepatocellular carcinoma:a cancer stem cell-specific target[J].Hepatology，2014，60(1):419-421.

[13]Forghanifard MM，Moghbeli M，Raeisossadati R，et al.Role of SALL4 in the progression and metastasis of colorectal cancer[J].J Biomed Sci，2013，20(3):6.

[14]張銘，張一鳴，左偉，等．干細(xì)胞標(biāo)志物SALL4在宮頸癌中的表達(dá)研究[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2014，43(3)：285-287

Expression and clinical significance of SALL4 expression in gastric carcinoma tissues*

GuoYong1，TangYongliang2，YangJuntao2,ZhangXin3，LiuLei4

(1.DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospitalofChangshou，Chongqing401220，China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,InstituteofSurgeryResearch，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China;3.DepartmentofGeneralSurgery，InstituteofSurgeryResearch，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China;4.CollegeofMedicine，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China)

ObjectiveTo study the expression and clinical significance of the SALL4 in human gastric carcinoma tissues.MethodsThe expression of SALL4 in 91 samples of gastric carcinoma and 37 samples of normal gastric tissues was detected by RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry，and its relationship with the clinical data were analyzed statistically.ResultsThe positive expression rate of SALL4 in gastric carcinoma(74.7%) was significantly higher than that(18.9%) in normal gastric mucosa tissues(P<0.05).Moreover，with the decreased with the differentiation of gastric carcinoma，the positive expression rate of SALL4 was increased.The expression of SALL4 mRNA and protein in gastric carcinoma tissues were significantly higher than that in normal gastric tissues(P<0.050).The expression levels of SALL4 were relevant to lymph node metastasis(P=0.001)，infiltration depth(P=0.029) and the differentiation degree of gastric carcinoma(P=0.050).ConclusionSALL4 was highly expressed in gastric cancer tissues and relevant to lymph node metastasis，infiltration depth and the differentiation degree，which may have play an important role in the development of gastric cancer.

gastric neaplasms;immunohistochemistry;SALL4

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.004

國(guó)家自然青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81402013)。

：郭勇(1981-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤方面的研究。

R735.2

A

1671-8348(2015)27-3756-03

2015-03-07

2015-06-27)