微小RNA204在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

張林超，趙俊峰，孫繼建

(河南省中醫(yī)院泌尿外科，鄭州 450002)

論著·基礎(chǔ)研究

微小RNA204在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

張林超，趙俊峰，孫繼建

(河南省中醫(yī)院泌尿外科，鄭州 450002)

目的 研究微小RNA204(miR-204)在人腎透明細(xì)胞癌(RCCC)中的表達(dá)及臨床意義。方法收集泌尿外科行手術(shù)切除的RCCC及對應(yīng)癌旁正常腎臟組織標(biāo)本共65例，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-204在RCCC及癌旁組織中的表達(dá)水平，統(tǒng)計分析miR-204表達(dá)水平與患者臨床病理資料間的相關(guān)性；采用人工合成的miR-204模擬物轉(zhuǎn)染人RCCCCaki-1細(xì)胞，分別采用qRT-PCR及Western-Blot檢測轉(zhuǎn)染后miR-204下游潛在靶點(diǎn)Bcl-2及SIRT1 mRNA及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果miR-204在RCCC組織中表達(dá)水平顯著低于對應(yīng)癌旁正常腎組織(P<0.05)；miR-204低表達(dá)與腫瘤體積增大(>3 cm，P<0.05)、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期，P<0.05)顯著相關(guān)；miR-204轉(zhuǎn)染人RCCCCaki-1細(xì)胞后可顯著降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及SIRT1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論miR-204在RCCC組織中表達(dá)下調(diào)并與腫瘤惡性臨床病理特征有關(guān)，miR-204可能通過下調(diào)Bcl-2及SIRT1的表達(dá)來抑制RCCC的發(fā)生、發(fā)展過程。

微小RNA204；腎透明細(xì)胞癌；基因，Bcl-2

腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，起源于腎小管上皮組織，約占全部惡性腫瘤的3%左右[1]。RCCC早期無明顯癥狀，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已因發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去了進(jìn)行根治手術(shù)的機(jī)會[2]。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，癌基因與抑癌基因的相互作用在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用日益突出，但其具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

微小RNA(microRNAs，miRNA)是一類長約18～25 nt的非編碼小RNA，它能夠與靶基因的mRNA特異性結(jié)合進(jìn)而抑制mRNA的翻譯過程或降解mRNA單鏈[3]。miR-204已經(jīng)被證實是一種重要的腫瘤調(diào)節(jié)基因，在多種人類惡性腫瘤中存在表達(dá)下調(diào)甚至缺失，并與腫瘤增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-8]。但是，miR-204在人RCCC中的臨床病理意義及其具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過檢測miR-204在RCCC、對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況及其對下游潛在靶點(diǎn)Bcl-2、SIRT1的調(diào)控作用，研究miR-204在RCCC發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義作用機(jī)制，為RCCC的診斷與治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 本課題經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)審核后開展。收集2012年1月至2014年3月于本院泌尿外科行手術(shù)切除的RCCC(觀察組)及對應(yīng)癌旁組織(距手術(shù)切緣大于2 cm，對照組)標(biāo)本65例，其中男35例，女30例，年齡31～70歲，平均(47.2±2.1)歲，其中29例患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)uhrman分級Ⅰ～Ⅱ級者44例，Ⅲ～Ⅳ級者21例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者37例，Ⅲ～Ⅳ期者28例。所有入組患者術(shù)前均未接受放、化療。標(biāo)本于離體30 min內(nèi)取材，分別置于液氮或4%多聚甲醛溶液中保存。

1.2 儀器與試劑 Trizol試劑及脂質(zhì)體2000(lipofectamineTM2 000)購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；real time PCR試劑盒購自寶生生物工程(大連)有限公司；miR-204特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、RNU6B引物及人工合成的miR-204模擬物均購自廣州銳博生物科技有限公司；Bcl-2引物(5′-CCT TTG TGT AAC TGT ACG GCC-3′；5′-CTT TGG CAG TAA ATA GCT GAT TCG AC-3′)，SIRT1引物(5′-CAA AGG AGC AGA TTA GTA GGC G-3′；5′-CTC TGG CAT GTC CCA CTA T CA C-3′)，β-actin引物(5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′；5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′)由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；兔抗人Bcl-2多克隆抗體(#2876)、兔抗人SIRT1多克隆抗體(#2496)購自美國CST公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體(sc-47778)購自美國Santa Cruz公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Milipore公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 按RNA提取試劑說明書方法提取RCCC及癌旁組織中的miRNA及mRNA，按以下條件進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：預(yù)變性70 ℃ 5 min，逆轉(zhuǎn)錄37 ℃ 1 h，酶滅活85 ℃ 5 min。以2 μL cDNA配制Real-time PCR體系，按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性 95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火延伸60 ℃ 30 s,擴(kuò)增40個循環(huán)。以RNU6B基因或β-actin基因為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-204相對表達(dá)量。每個樣本獨(dú)立重復(fù)實驗3次。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人RCCC Caki-1細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS的1×DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。每2～4日傳代1次，穩(wěn)定傳代2～3代后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Caki-1細(xì)胞接種于6孔板中，用含10%FBS的1×DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)50%左右，實驗分組及處理如下：實驗組每孔加入100 pmoL miR-204模擬物及5 μL轉(zhuǎn)染試劑；對照組每孔加入100 pmoL 陰性對照(negative control,NC)模擬物及5 μL轉(zhuǎn)染試劑。每孔加入不含血清的1×DMEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 mL，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。獨(dú)立重復(fù)實驗3次。

1.3.4 Western blot 取轉(zhuǎn)染72 h后的Caki-1細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液置冰上裂解10 min，裂解液收集于1.5 mL EP管中，4 ℃、14 000 r/min離心10 min后取上清液。BCA法測定總蛋白濃度，每孔加入50 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。采用BIO-RAD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，20V轉(zhuǎn)膜1 h，5% BSA室溫封閉1.5 h后加入1∶1 000稀釋的Bcl-2一抗、SIRT1一抗及β-actin一抗，4 ℃搖晃孵育過夜，0.01 M TBST漂洗5 min×3次后加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h。0.01 M TBST漂洗5 min×3次。于暗室內(nèi)，在膜上滴加ECL溶液，并使膠片曝光，全自動洗片機(jī)洗片。每樣本獨(dú)立重復(fù)實驗3次。

2 結(jié) 果

2.1 RCCC組織及對應(yīng)癌旁組織中miR-204的相對表達(dá)量比較 經(jīng)qRT-PCR技術(shù)檢測，65例RCCC組織中miR-204的相對表達(dá)量顯著低于癌旁正常腎臟組織(2.344±0.193vs. 8.617±0.482),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miR-204表達(dá)水平與RCCC患者臨床病理特征間的相關(guān)性 為研究miR-204表達(dá)水平與腫瘤臨床特征間的相關(guān)性，將65例腫瘤標(biāo)本按表1所列項目分組，經(jīng)student-t檢驗，RCCC組織中miR-204低表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積增大(>3 cm)和高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)間具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。

表1 miR-204表達(dá)與RCCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 過表達(dá)miR-204對RCCC Caki-1細(xì)胞中Bcl-2及SIRT1表達(dá)的影響 向Caki-1細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染入miR-204模擬物后可顯著升高細(xì)胞內(nèi)miR-204的表達(dá)水平(圖1A，P<0.05)。qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達(dá)miR-204顯著下調(diào)了Caki-1細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及SIRT-1 mRNA(圖1B)和蛋白(圖1C)的表達(dá)水平(P<0.05)。

*：P<0.05，與對照組比較；1：對照組；2:觀察組。

圖1 過表達(dá)miR-204下調(diào)Caki-1細(xì)胞中Bcl-2及SIRT1的表達(dá)

3 討 論

RCCC是最常見的腎臟惡性腫瘤之一。由于早期癥狀隱匿，約30%的患者就診時就因已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去根治手術(shù)機(jī)會，而在可手術(shù)切除的RCCC患者中，也仍有30%的患者會發(fā)生早期局部復(fù)發(fā)[9]，這提示RCCC有著較高的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移潛能，但其具體分子機(jī)制尚不完全清楚。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，RCCC組織中存在大量miRNA異常表達(dá),并在RCCC的生物學(xué)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。如miR-210、miR-122、miR-34a、miR-21在RCCC組織中表達(dá)顯著升高，而miR-135a、miR-1973的表達(dá)水平則較正常腎組織明顯下調(diào)[10]。Chen等[11]檢測了68例RCCC組織中miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有74種miRNA存在異常表達(dá)，其中 miR-141在92.6%的RCCC中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)并與患者不良預(yù)后有關(guān)，體外研究證實，過表達(dá)miR-141可顯著抑制RCCC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。本課題通過研究證實，miR-204在RCCC組織中的表達(dá)水平顯著低于對應(yīng)癌旁組織，并且其低表達(dá)狀態(tài)與腫瘤體積增大、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期等惡性臨床病理特征密切相關(guān)。提示miR-204在RCCC進(jìn)展中具有重要的調(diào)控作用。

作為一種重要的抑癌分子，miR-204可通過下調(diào)腫瘤中MEIS1、FOXC1、Mcl-1等多個癌基因的表達(dá)水平來發(fā)揮其抗腫瘤作用[12-14]。為進(jìn)一步研究miR-204對RCCC的抑癌分子調(diào)控機(jī)制，通過體外轉(zhuǎn)染方法，在RCCC細(xì)胞Caki-1中成功過表達(dá)miR-204，通過qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-204后，Caki-1細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及SIRT1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)。在臨床實踐中，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療方案在RCCC的化療中具有重要作用，新近研究證實，miR-204可通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)來增強(qiáng)胃癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤對順鉑的化療敏感性，本課題研究結(jié)果也表明miR-204可顯著下調(diào)RCCC腫瘤細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，結(jié)合miR-204在RCCC組織中的低表達(dá)狀態(tài)，提示miR-204表達(dá)缺失可能是RCCC患者對鉑類藥物化療耐藥的重要機(jī)制之一。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制之一，在胃癌中的研究表明[15]，miR-204能夠通過下調(diào)胃癌細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控E鈣黏蛋白、N鈣黏蛋白等多種EMT重要分子的表達(dá)水平，來最終實現(xiàn)抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。本課題體外實驗證實，過表達(dá)miR-204可顯著下調(diào)RCCC細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)水平，組織學(xué)研究表明，miR-204低表達(dá)與RCCC腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期密切相關(guān)，結(jié)合既往研究結(jié)果可以推測miR-204可能通過下調(diào)RCCC細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)、抑制腫瘤EMT來發(fā)揮其抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移作用。

綜上所述，miR-204在RCCC組織表達(dá)顯著下調(diào)，低表達(dá)miR-204與RCCC惡性臨床病理特征密切相關(guān)。miR-204可能通過下調(diào)Bcl-2及SIRT1的表達(dá)水平從而發(fā)揮其腫瘤抑制作用。因此，miR-204在RCCC的診斷及生物分子治療中可能具有一定的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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Expression and clinical significance of microRNA-204 in human renal clear cell carcinoma

ZhangLinchao,ZhaoJunfeng,SunJijian

(DepartmentofUrology,HenanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou,Henan450002,China)

Objective To inveatigate the expression and clinical significance of microRNA-204(miR-204) in human renal clear cell carcinoma(RCCC).Methods 65 cases of resected RCCC tissue and corresponding normal tumor-adjacent tissue were collected and detected the expression level of miR-204 by using qRT-PCR.The correlation between the miR-204 expression level and clilicalpathological features was statistically analyzed.The artificial miR-204 mimics were adopted to stranfect into Caki-1 cells,then the Western blot was used to detect the expression of Bcl-2 a as the downstream potential targets of miR-204 and SIRT1 mRNA and protein.Results The expression level of miR-204 in the RCCC tissue was significantly lowere than that in the normal tumor-adjacent tissues (P<0.05);the low expression of miR-204 was significantly associated with the tumor size(>3 cm,P<0.05),lymph node metastasis(P<0.05) and advanced TNM stage(Ⅲ+Ⅳ,P<0.05).Both the mRNA and protin expression in RCCC Caki-1 cells were down-regulated after transfection.Conclusion The expression of miR-204 is down-regulated in the RCCC tissue and is related to the malignant clinicopathological features,and miR-204 may suppress the RCCC genesis and development through down-regulating the expression of Bcl-2 and SIRT1.

mircoRNA-204;renal clear cell carcinoma;genes,Bcl-2

張林超(1972-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腎腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究工作。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.006

R737.11

A

1671-8348(2015)15-2034-03

2014-12-10

2015-02-15)