不同順丁烯二酰亞胺類化合物的制備及對灰霉病的抑制效果

江 文，陸躍樂，范永仙，陳小龍

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310014）

不同順丁烯二酰亞胺類化合物的制備及對灰霉病的抑制效果

江 文，陸躍樂，范永仙，陳小龍*

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310014）

為解決灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）抗藥性難題，篩選出高效、低毒的順丁烯二酰亞胺類新型抗菌劑，本實驗以3種常用的農(nóng)藥中間體對叔丁基芐胺、2，3-二氯-4-羥基苯胺和4-（4-甲基苯氧基）芐胺與7種不同順丁烯二酸酐為底物，采用乙酸法、DMF法和甲醇法制備了21種順丁烯二酰亞胺類化合物；所有化合物通過1H NMR和ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。實驗采用菌絲生長速率法初步研究了21種新型順丁烯二酰亞胺類化合物對B.cinerea菌絲生長的抑制效果。結(jié)果表明，5種化合物（Ⅰ-1，Ⅲ-1，Ⅲ-3，Ⅲ-4和Ⅲ-5）對B.cinerea菌絲生長抑制較強，已超過商用殺菌劑氯硝胺（EC50=15.89μg·m L-1），這為開發(fā)新型抗菌劑提供了研究基礎(chǔ)。

順丁烯二酰亞胺；灰霉病菌；抑制效果

目前，植物致病真菌是引起植物病害最重要的因素，約有70%的植物病害是因為真菌引起的，真菌能引起多種植物病害，對各國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失［1］?；颐共∈怯苫移咸焰呔秩舅碌囊环N世界性植物病害，可對多種水果、谷類、蔬菜、豆類產(chǎn)生病害，尤其是葡萄、草莓、胡蘿卜、黃瓜等，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。因此開發(fā)新型殺菌劑對灰霉病的防治與抗藥性治理具有重要意義。

順丁烯二酰亞胺類化合物的α，β不飽和二酰亞胺環(huán)狀結(jié)構(gòu)決定了它在化學(xué)工業(yè)中的重要作用，該類化合物在農(nóng)藥化學(xué)上對許多細(xì)菌、酵母、真菌等微生物具有良好的抑制作用［4］。然而該類化合物種類單一，部分毒性大，限制了其在農(nóng)業(yè)上的使用。4-叔丁基芐胺、4-（4-甲基苯氧基）芐胺和2，3-二氯-4-羥基苯胺分別是殺螨劑吡螨胺、殺蟲劑唑蟲酰胺和殺菌劑環(huán)酰菌胺的重要合成中間體［5-7］，同時它們都含有一個伯氨基，因此能夠與不同順丁烯二酸酐反應(yīng)制備順丁烯二酰亞胺類化合物。作者利用4-叔丁基芐胺、2，3-二氯-4-羥基苯胺、4-（4-甲基苯氧基）芐胺與不同順丁烯二酸酐合成了一系列順丁烯二酰亞胺類化合物，并通過體外試驗檢測其對灰霉病菌的抑菌活性。這為篩選具有高抑菌活性的新型順丁烯二酰亞胺類化合物，以期為我國新型抗菌劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

馬來酸酐、檸康酸酐、二氯馬來酸酐、二苯基馬來酸酐（阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰荆患状?、乙酸、乙酸乙酯、石油醚（杭州華林化工儀器公司）。所有試劑均為分析純。核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific）；GXZ型智能光照培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；SW-CJ-6超凈凈化工作臺（上海錦昱科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 不同順丁烯二酰亞胺類化合物合成與分離

化合物Ⅰ-1～Ⅰ-6和Ⅱ-1～Ⅱ-6采用乙酸法（Path A）制備［8］。稱取不同酸酐0.001 5和0.001 mol· L-1各有機胺加入到裝有磁力攪拌子的三口燒瓶中，再加入15 mL冰醋酸溶解，加熱回流反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓蒸餾，除去溶劑，得到濃縮液，將濃縮液進(jìn)行薄層層析或硅膠柱層析分離（洗脫劑V石油醚∶V乙酸乙酯為8～16∶1），并收集目標(biāo)液，真空旋轉(zhuǎn)去溶劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物（圖1）。

圖1 順丁烯二酰亞胺類化合物的合成

化合物Ⅲ-1～Ⅲ-4的制備。稱取不同酸酐0.001 5和0.001 mol·L-1各有機胺加入到裝有磁力攪拌子的三口燒瓶中，加入15 mL DMF，30～40℃下反應(yīng)約30 min，再滴加1 mmol P2O5，30μL濃硫酸與1 mL DMF混合溶液，75℃下攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，利用乙酸乙酯和水分別萃取2次，再通過無水Na2SO4除水，得有機相經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到濃縮液，將濃縮液進(jìn)行硅膠柱層析分離（洗脫劑V石油醚∶V乙酸乙酯∶V乙酸為2 m L∶1 mL∶20μL），并收集目標(biāo)液，真空旋轉(zhuǎn)去溶劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物。

化合物Ⅰ-7，Ⅱ-7，Ⅲ-5，Ⅲ-6和Ⅲ-7采用甲醇鈉溶液制備［9］。稱取不同有機胺0.001 mol·L-1加入已裝有磁力攪拌子的圓底燒瓶中，加入5 m L的0.26 mol·L-1的甲醇鈉溶液，再加入0.001 5 mol·L-1不同酸酐化合物，25～35℃反應(yīng)1 h，加入150μL三乙胺，反應(yīng)20 min，最后升溫至45～70℃，反應(yīng)1～3 h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓蒸餾，除去溶劑，得到濃縮液，將濃縮液進(jìn)行薄層層析或硅膠柱層析分離（洗脫劑V石油醚∶V乙酸乙酯為8～16∶1），并收集目標(biāo)液，真空旋轉(zhuǎn)去溶劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物。所有化合物通過1H NMR和ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.3 活性檢測

1.3.1 供試菌

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）（中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號ACCC30387）。

1.3.2 含藥培養(yǎng)基平板的制備

供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。首先吸取同一藥物從低濃度到高濃度不同濃度各1 m L，加入直徑為9.0 cm的無菌培養(yǎng)皿中，其次加入加熱融化的PDA培養(yǎng)基9.0 m L，以“8”字形充分混勻，最后得到稀釋10倍的藥物濃度，最終配制成濃度分別為200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39μg·m L-1的含藥PDA培養(yǎng)基平板，每個梯度設(shè)2個平行，其中以加入1.0 m L 0.1%的吐溫80和9.0 m L已滅菌融化的PDA培養(yǎng)基為對照，以10.0 m L已滅菌融化的PDA培養(yǎng)基為空白。

1.3.3 抗菌活性測定方法

采用菌絲生長速率法［10］測定。用直徑6.0 mm的打孔器在固體PDA的邊緣取活化好的灰葡萄孢菌碟，將菌碟菌絲面朝下，分別接種至含藥PDA培養(yǎng)基平板和對照組培養(yǎng)基平板的正中央，于23℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照菌落直徑在50～80 mm時（灰葡萄孢一般需要72 h才能達(dá)到測量要求），采用十字交叉法測量菌落生長直徑，每個梯度可得4個數(shù)值，求其平均值得到較準(zhǔn)確的藥劑處理的菌落直徑和對照菌落直徑，求取抑制率。菌絲生長抑制率/%=100×［1-（藥劑處理的菌落直徑-6）/（對照的菌落直徑-6）］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同順丁烯二酰亞胺類化合物的制備

已報道的關(guān)于順丁烯二酰亞胺類化合物的合成，主要采用兩步法合成，乙酸酐法和共沸法，用一步法（乙酸法）合成［11］。順丁烯二酰亞胺類化合物Ⅰ-1～Ⅰ-6和Ⅱ-1～Ⅱ-6即利用乙酸法合成，反應(yīng)時間較兩步法短，產(chǎn)率較高，達(dá)70%以上，是合成順丁烯二酰亞胺類化合物理想的方法。但乙酸（反應(yīng)溫度60～100℃）作為溶劑，產(chǎn)率可達(dá)55%～80%。因此溫度控制是影響反應(yīng)產(chǎn)率的一個重要方面，在達(dá)到乙酸沸點（117℃）后將溫度稍提高，回流攪拌反應(yīng)，產(chǎn)率得到提高。另一方面，因為乙酸分離較為困難，反應(yīng)結(jié)束后除去乙酸過程中產(chǎn)物會有部分損失，導(dǎo)致成本增加。同時對剩余的順丁烯二酰亞胺類化合物利用乙酸法均未達(dá)到理想結(jié)果，且有的產(chǎn)率極低。最主要的問題是副產(chǎn)物太多，導(dǎo)致無法較好的分離純化。主要原因可能是側(cè)鏈有雙甲基、苯基等存在，空間位阻較大，無法合成相應(yīng)的順丁烯二酰亞胺類化合物。合成的順丁烯二酰亞胺類化合物如圖2所示。

對于Ⅲ-1～Ⅲ-4的合成，首先嘗試的是乙酸法，反應(yīng)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)有較多副產(chǎn)物產(chǎn)生。經(jīng)檢測，2，3-二氯-4-羥基苯胺上的氨基并未發(fā)生反應(yīng)，這是由于該胺的羥基活性較氨基強，故易與酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)，卻很難與氨基發(fā)生酰胺化。因此采用以DMF作溶劑，再脫水閉環(huán)的兩步法合成相應(yīng)的順丁烯二酰亞胺類化合物，分離純化后產(chǎn)率達(dá)到80%左右。

甲醇法，即在甲醇鈉的甲醇溶液中，游離的順丁烯二酸酐與胺反應(yīng)。第一步生成酰胺酸，第二步是在三乙胺的作用下發(fā)生閉環(huán)脫水反應(yīng)，生成順丁烯二酰亞胺。為了操作簡便，在反應(yīng)過程中生成的副產(chǎn)物NaCl不需要分離，直接進(jìn)行操作。

圖2 合成的順丁烯二酰亞胺類化合物

2.2 不同順丁烯二酰亞胺類化合物對離體B. cinerea菌絲生長的抑制效果

EC50表示半抑制B.cinerea生長的有效濃度，可明顯反映各化合物抑菌濃度的差異，故選其作為主要比較參數(shù)（表1）。上述21種順丁烯二酰亞胺類化合物中，Ⅰ-1，Ⅲ-1，Ⅲ-3，Ⅲ-4和Ⅲ-5對離體B.cinerea生長抑制較強，已超過商用殺菌劑氯硝胺（EC50=15.89μg·m L-1）。其余大部分不同的順丁烯二酰亞胺類化合物對B.cinerea生長均具有一定的抑制作用。其中除Ⅰ-2，Ⅰ-6，Ⅰ-7，Ⅱ-3，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅱ-6和Ⅱ-7這8種順丁烯二酰亞胺類衍生物的EC50＞100μg·mL-1外，剩余的化合物對抑制B.cinerea菌絲生長都表現(xiàn)出較好的抑制效果。同時根據(jù)酰亞胺環(huán)上2，3位上基團(tuán)的變化，這類化合物會具有不同的抑菌效果［12］。經(jīng)研究得出，當(dāng)2，3位上沒有其他官能團(tuán)時，這類化合物對真菌等具有較強的抑菌作用，其中的原因有可能是因為酰亞胺是由p-π共軛雙鍵形成的環(huán)狀化合物，對電子的親和力較強，具有電子接受體的性質(zhì)，同時使酰亞胺環(huán)上的碳正離子易受到親核攻擊，但由于2，3位上基團(tuán)的改變，使酰亞胺環(huán)上的電子云發(fā)生改變，從而影響抑菌效果，這對今后篩選抑菌活性較高的順丁烯二酰亞胺類化合物具有一定的指導(dǎo)意義。

表1 新型順丁烯二酰亞胺類化合物對離體B.cinerea的抑制作用

3 小結(jié)與討論

本文用乙酸法合成順丁烯二酰亞胺類化合物對比于常用的兩步合成法，反應(yīng)時間短，產(chǎn)率高，是合成順丁烯二酰亞胺類化合物的理想方法。DMF法主要是使含羥基的胺與部分酸酐反應(yīng)，產(chǎn)率較高。甲醇法可使2，3位空間位阻較大的酸酐，尤其是二甲基順丁烯二酸酐與胺反應(yīng)，反應(yīng)時間短，分離簡單。

目前關(guān)于順丁烯二酰亞胺類化合物用作B. cinerea等植物致病真菌的殺菌劑方面的研究較少。其對體外B.cinerea菌絲生長的抑制效果表明，大多數(shù)順丁烯二酰亞胺類化合物對其具有很好的抑制效果，尤其是Ⅰ-1，Ⅲ-1，Ⅲ-3，Ⅲ-4和Ⅲ-5對離體B.cinerea生長抑制較強。因此，順丁烯二酰亞胺類化合物具有開發(fā)為新型殺菌劑農(nóng)藥的巨大潛力。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 432

：A

：0528-9017（2015）10-1611-04

文獻(xiàn)著錄格式：江文，陸躍樂，范永仙，等.不同順丁烯二酰亞胺類化合物的制備及對灰霉病的抑制效果［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（10）：1611-1614.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151029

2015-05-14

江 文（1990-），男，安徽桐城人，在讀碩士，研究方向為生物轉(zhuǎn)化與生物催化。E-mail：jiang8796@126.com。

陳小龍。E-mail：jiang8796@126.com。