復(fù)方鹿角霜片的質(zhì)量控制*

張雨薇，王燕燕，王亞芬，張凱林

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院、宜昌市中心人民醫(yī)院，宜昌 443003；2.湖北華龍生物制藥有限公司，孝感 430028)

復(fù)方鹿角霜片的質(zhì)量控制*

張雨薇1，王燕燕1，王亞芬2，張凱林2

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院、宜昌市中心人民醫(yī)院，宜昌 443003；2.湖北華龍生物制藥有限公司，孝感 430028)

目的建立復(fù)方鹿角霜片的質(zhì)量控制方法。方法采用薄層色譜法對(duì)制劑中鹿銜草、忍冬藤進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定忍冬藤中的馬錢苷、當(dāng)藥苷，鹿銜草中的水晶蘭苷的含量。結(jié)果定性鑒別薄層色譜斑點(diǎn)清晰，特征明顯，專屬性強(qiáng)；高效液相色譜法測定含量，專屬性強(qiáng)，在范圍內(nèi)水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷進(jìn)樣濃度與色譜峰面積均呈良好的線性關(guān)系(r>0.999)，平均回收率分別為97.2%，98.4%，96.0%，RSD分別為1.4%，0.8%，0.8%。結(jié)論利用薄層色譜法定性、高效液相色譜法定量，方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可有效控制復(fù)方鹿角霜片的質(zhì)量。

鹿角霜片，復(fù)方；水晶蘭苷；馬錢苷；當(dāng)藥苷；色譜法，高效液相；質(zhì)量控制

復(fù)方鹿角霜處方來源于宜昌名老中醫(yī)孫庭富祖?zhèn)饕话儆嗄甑慕?jīng)驗(yàn)方，具有強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)、除濕，疏利關(guān)節(jié)，抗炎消腫的功效，被宜昌市中心人民醫(yī)院引用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1]。該處方由鹿角霜、鹿銜草、忍冬藤、蜂房、桂枝和桑枝6味藥材組成。有報(bào)道稱鹿角霜具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用[2-3]，鹿銜草提取物能夠抑制一氧化氮的產(chǎn)生進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[4]，忍冬藤水煎液對(duì)小鼠卡拉膠性足跖腫脹炎癥模型和二甲苯性耳廓腫脹炎癥模型均具有較好的抗炎作用[5]，蜂房水提液也具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[6-7]。本品用于治療多種類型的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效確切，安全可靠，不良反應(yīng)少，并且能在一定程度上減少糖皮質(zhì)激素用量，從而降低用藥毒副反應(yīng)，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高患者生活質(zhì)量，用藥前景良好。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)量控制研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀(色譜工作站：Chromeleon，進(jìn)樣器：U3000型自動(dòng)進(jìn)樣器；檢測器：DAD 3000型)；BT-25S型電子分析天平(Satorius，感量：0.01 mg)；KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；

1.2 試藥 水晶蘭苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111870-201302)；馬錢苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111640-201005)；當(dāng)藥苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111742-200501)；復(fù)方鹿角霜片(武漢健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：20130601，20130602，20130603，每片0.45 g)；乙腈為色譜純；水為雙蒸水；其他試劑皆為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 忍冬藤的薄層層析鑒別 取本品5片，除去包衣，研細(xì)，加乙醇20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至約3 mL，置已處理好的活性炭-氧化鋁柱上[依次加入活性炭0.5 g及中性氧化鋁2 g，內(nèi)徑10～20 mm]，用乙醇30 mL洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取馬錢苷對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取忍冬藤對(duì)照藥材2 g，加乙醇30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。再按處方比例稱取除忍冬藤外的其余5味藥材，同法制得陰性樣品溶液，按供試品溶液的制備進(jìn)行提取，即得[8]。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液及對(duì)照藥材溶液各5 μL、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-水(12：3：5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。見圖1。

1.馬錢苷；2.忍冬藤對(duì)照藥材；3.復(fù)方鹿角霜片；4.陰性對(duì)照

圖1 忍冬藤的薄層色譜鑒別[溫度：(15±2) ℃；相對(duì)濕度：(70±5)%]

1.loganin；2.reference of lonicerae japonicae caulis；3.compound cornu cervi degelatinatum tablets；4.negative control

Fig.1 Qualitative identification of lonicerae japonicae caulis by TLC[temperature：(15±2) ℃；relative humidity：(70±5)%]

2.1.2 鹿銜草的薄層層析鑒別 取本品5片，除去包衣，研細(xì)，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，取上清液作為供試品溶液。取鹿銜草對(duì)照藥材1 g，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，取上清液作為對(duì)照藥材溶液。另按處方比例稱取除鹿銜草外的其余五味藥材，同法制得陰性樣品溶液[9]。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液5 μL、3批供試品溶液(批號(hào)：20130601，20130602，20130603)及陰性樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5：4：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相同位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，見圖2。

1.鹿銜草對(duì)照藥材；2～4.3批復(fù)方鹿角霜片；5.陰性對(duì)照

圖2 鹿銜草的薄層色譜鑒別[溫度：(15±2) ℃；相對(duì)濕度：(70±5)%]

1.reference of pyrola herba；2-4.three batches of compound cornu cervi degelatinatum tablets；5.negative control

Fig.2 Qualitative identification of pyrola herba by TLC [temperature：(15±2) ℃；relative humidity：(70±5)%]

2.1.3 忍冬藤和鹿銜草的高效液相色譜法鑒別 在”2.2.5”項(xiàng)下含量測定專屬性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的供試品液相色譜圖中，供試品應(yīng)顯示與水晶蘭苷、馬錢苷和當(dāng)藥苷對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，見圖3。

2.2 復(fù)方鹿角霜片含量測定

2.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以0.4%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相，按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。柱溫27 ℃，檢測波長236 nm，流速1.0 mL·min-1[10]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷對(duì)照品各10 mg，精密加水定容至50 mL至溶解，制成每毫升中含水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷各200 μg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液適量，加水定量稀釋成每毫升含水晶蘭苷40 μg、

A.缺忍冬藤陰性樣品溶液；B.缺鹿銜草陰性樣品溶液；C.混合對(duì)照品溶液；D.供試品溶液；1.水晶蘭苷；2.馬錢苷；3.當(dāng)藥苷

圖3 復(fù)方鹿角霜片專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖

A.negative control without lack of lonicerae japonicae caulis；B.negative control without pyrolae herba；C.mixed control solution；D.samples；1.monotropein；2.loganin；3.chiratin

Fig.3 Chromatograms of specificity test on compoundcornucervidegelatinatumtablets

馬錢苷40 μg及當(dāng)藥苷40 μg的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

表1 含量測定流動(dòng)相條件

Tab.1 Mobile phase of content determination %

時(shí)間/min0．4%磷酸溶液乙腈0982～11982～1298→862→14～408614～5086→9814→2

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液[11-12]。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例分別制備不含忍冬藤和鹿銜草的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法同法制備忍冬藤陰性樣品溶液以及鹿銜草陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液以及陰性樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示陰性樣品溶液色譜圖中在與混合對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)的位置上無色譜峰出現(xiàn)，陰性無干擾，見圖3。

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下的水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取對(duì)照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0 mL置1～7號(hào)10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取10 μL依次注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。由溶液濃度(X)對(duì)色譜峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 3種成分的回歸方程 Tab.2 Regression equation of three constituents

2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取供試品溶液(復(fù)方鹿角霜片，批號(hào)：20130601)，重復(fù)進(jìn)樣6次，水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷色譜峰面積的RSD%分別為0.6%，0.6%，0.7%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取供試品溶液(復(fù)方鹿角霜片，批號(hào)：20130601)，室溫放置，分別于0，1，2，4，8，12，16，24 h時(shí)，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD。水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷峰面積的RSD分別為0.8%，0.7%，0.9%，說明待測液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的供試品(批號(hào)：20130601，水晶蘭苷含量：1.213 mg·g-1，馬錢苷含量3.087 mg·g-1，當(dāng)藥苷含量1.547 mg·g-1) 6份，每份約1.0g，精密稱定，置100 mL量瓶中，分別精密加入水晶蘭苷0.373 6 mg·mL-1、馬錢苷0.425 2 mg·mL-1及當(dāng)藥苷0.401 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液各5 mL，照供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見表3。

2.2.10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：20130601)6份，照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行配制，進(jìn)行液相分析，計(jì)算得水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷含量的RSD分別為1.3%，1.2%，1.1%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.11 供試品含量測定 分別稱取3個(gè)不同批次的復(fù)方鹿角霜片樣品各1.0 g，依法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定供試品溶液中水晶蘭苷、馬錢苷、當(dāng)藥苷含量，結(jié)果見表4。

3 討論

鹿角霜《中華人民共和國藥典》2010年版收載中僅用外觀性狀來進(jìn)行鑒別，無特異性方法。鑒于鹿角霜與鹿茸等鹿制品均含多種氨基酸，參照《中華人民共和國藥典》2010年版一部鹿茸項(xiàng)下的鑒別方法對(duì)鹿角霜進(jìn)行了理化及薄層色譜鑒別方法預(yù)試，結(jié)果表明供試液中蜂房提取物對(duì)測定有干擾，不適用于本品中鹿角霜的鑒別，但將理化鑒別、薄層鑒別訂入鹿角霜藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以達(dá)到控制成品的質(zhì)量。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，桂枝的鑒別方法大多采用桂皮醛等揮發(fā)油，但由于本品采用水提醇沉工藝，桂皮醛等成份的提取率較低，不適用于本品中桂枝的鑒別，故未采用。桑枝《中華人民共和國藥典》收載中僅采用顯微方法進(jìn)行鑒別。由于本處方中桑枝非原藥材粉入藥，是采用水煮醇沉工藝制得，故顯微鑒別方法不可行。參照《中華人民共和國藥典》2010年版一部桑白皮項(xiàng)下薄層鑒別方法，對(duì)本品中桑枝鑒別進(jìn)行了方法學(xué)研究，結(jié)果顯示陰性對(duì)照有干擾，不適合本品中桑枝的鑒別。

經(jīng)方法學(xué)研究表明：鹿銜草及忍冬藤薄層鑒別方法展開效果良好，專屬性強(qiáng)，最終將鹿銜草、忍冬藤鑒別訂入了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

由于中藥處方的成分復(fù)雜且含量微小，一般的方法難以對(duì)復(fù)雜的中藥處方進(jìn)行分離和檢測[13]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中選用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法同時(shí)測定復(fù)方鹿角霜片中水晶蘭苷、馬錢苷以及當(dāng)藥苷3種有效成分，方法靈敏，簡便，可操作性強(qiáng)。建立方法的同時(shí)進(jìn)一步對(duì)流速、柱溫、流動(dòng)相比例、測定波長等因素進(jìn)行了篩選。根據(jù)二極管陣列檢測器采集得到的在190～400 nm波長范圍內(nèi)結(jié)果，最終選擇236 nm作為檢測波長，與《中華人民共和國藥典》2010年版一部鹿銜草中水晶蘭苷，忍冬藤中馬錢苷含量測定檢測波長基本一致。

通過本研究建立的復(fù)方鹿角霜片薄層色譜定性鑒別，以及高效液相色譜定量測定的方法，簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

表3 3種成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab.3 Results of recovery tests on three constituents

表4 3批復(fù)方鹿角霜片每片含量測定結(jié)果

Tab.4 Results of content determination on each tablets of three batches of compoundcornucervidegelatinatumtablets

mg

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《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》編輯部

Quality Control of Compound Cornu Cervi Degelatinatum Tablets

ZHANG Yuwei1, WANG Yanyan1, WANG Yafen2, ZHANG Kailin2

(1.TheFirstCollegeofClinicalMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity&YichangCentralPeople`sHospital,Yichang443003,China； 2.HubeiHualongBiopharmaceuticalLimitedCompany,Xiaogan430028,China)

Objective To establish a method of quality control for compoundCornucervidegelatinatumtablets. Methods Thin layer chromatography (TLC) was used for qualitative identification ofLoniceraeJaponicaeCaulisandPyrolaHerbain the preparations.High performance liquid chromatography was used to determine the content of loganin and chiratin inLoniceraeJaponicaeCaulisand monotropein inPyrolaHerba. Results The TLC spots were clear and specific in the qualitative identification.HPLC determined the content.In the concentration range, monotropein, loganin and chiratin had a good linear relationship with peak area (r>0.999).The mean recovery was 97.2%, 98.4% and 96.0%； RSD was 1.4%, 0.8% and 0.8%. Conclusion The present study employs TLC for quality control and HPLC for quantity control.The methods are simple and accurate, have good reproducibility, and can effectively control the quality of compoundCornucervidegelatinatumtablets.

Cornucervidegelatinatumtablets, compound； Monotropein； Loganin； Chiratin； Chromatography, high performance liquid； Quality control

2015-01-08

2015-03-12

*國家”重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2011ZX09102-006-05)

張雨薇(1990-)，女，黑龍江雞西人，在讀碩士，研究方向：天然藥物化學(xué)。電話：(0)13035132949，E-mail：m13035132949@163.com。

王燕燕(1964-)，女，湖北宜昌人，教授，博士研究生，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0717-6487741，E-mail：wangyy1001@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)12-1644-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.024

導(dǎo)報(bào)》論文

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