曲克蘆丁微乳的處方篩選及含量測定*

許曼，余慶，趙倩茹，陳偉，林元節(jié)，金涌

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032)

曲克蘆丁微乳的處方篩選及含量測定*

許曼，余慶，趙倩茹，陳偉，林元節(jié)，金涌

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032)

目的篩選親水性藥物曲克蘆丁油包水型口服微乳的最佳處方，考察其形態(tài)、粒徑大小、穩(wěn)定性，并建立其含量測定方法。方法利用偽三元相圖，以微乳形成區(qū)域大小為指標(biāo)，篩選制備微乳的最佳處方。采用高效液相色譜法測定微乳中藥物含量。結(jié)果篩選出的最佳處方是大豆磷脂/無水乙醇/肉豆蔻酸異丙酯/純化水=23.30：11.67：52.45：12.59。所制得的微乳外觀圓整，大小分布均勻，平均粒徑為50.20 nm，具有良好穩(wěn)定性。結(jié)論大豆磷脂/無水乙醇/肉豆蔻酸異丙酯/純化水體系將曲克蘆丁成功包載于水相，有望為曲克蘆丁口服給藥提供一種有效的新劑型。

曲克蘆??；偽三元相圖；微乳；質(zhì)量評(píng)價(jià)

曲克蘆丁是蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半合成黃酮類化合物，具有抑制紅細(xì)胞和血小板聚集、防止血栓形成的作用，臨床用于治療慢性靜脈功能不全、靜脈曲張、血栓癥及腦血管疾病[1]。曲克蘆丁口服后很少被吸收，生物利用度極低[2-3]。因此以提高生物利用度為目的對(duì)其進(jìn)行劑型改造具有重要的意義。微乳是由表面活性劑、助表面活性劑、水相和油相組成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，具有保護(hù)藥物避免胃腸道酶破壞、提高難溶性藥物的溶解度以及增加藥物生物利用度等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道油包水W/O型微乳可以提高水溶性藥物的生物利用度[4-5]。課題篩選最佳制備曲克蘆丁W/O型微乳的處方并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為后續(xù)研究曲克蘆丁微乳的吸收做準(zhǔn)備。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津)；79HW-1型恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；DDS-11AW型電導(dǎo)率儀(上海般特儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；Nano ZS90型激光納米粒度儀(英國馬爾文公司)；超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2 試藥 曲克蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100416-201004)；曲克蘆丁原料藥(批號(hào)：J1225037)、大豆油(批號(hào)：17532)為阿拉丁試劑上海有限公司提供；大豆磷脂(Lecithin，上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130404)；司盤80、聚山梨酯80、聚乙二醇400、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、無水乙醇、異丙醇、1，2-丙二醇均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；氫化蓖麻油7(上海厚誠精細(xì)化工有限公司)；辛癸酸甘油酯(西亞試劑)；甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 偽三元相圖的繪制 精密稱取表面活性劑和助表面活性劑于干燥潔凈的小安瓿瓶中，按一定比例溶解混勻(表面活性劑/助表面活性劑=Km)，即為混合表面活性劑，取此混合表面活性劑分別按9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9比例與油相混合，置于恒溫磁力攪拌器上，緩慢滴加純化水使體系充分混勻，肉眼觀察體系由澄清透明變渾濁時(shí)，記錄此時(shí)(臨界點(diǎn))加入的水量，并計(jì)算油相、水相、混和表面活性劑在臨界點(diǎn)各自的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，利用Origin8.0繪制偽三元相圖，確定微乳區(qū)。

2.2 微乳處方的初步篩選 選用氫化蓖麻油7、司盤80、大豆磷脂、司盤80和聚山梨酯80復(fù)配、司盤80和泊洛沙姆188復(fù)配為表面活性劑作為篩選對(duì)象，以無水乙醇、異丙醇、1，2-丙二醇、聚乙二醇400為助表面活性劑?？疾觳煌N類表面活性劑和助表面活性劑的互溶情況，初步篩選混合表面活性劑的組成。固定Km值為1：1，混合表面活性劑與油相(肉豆蔻酸異丙酯、辛癸酸甘油酯、油酸乙酯、大豆油)以1：1混合后滴加水，考察各組合微乳形成難易及載水量大小。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，司盤80和泊洛沙姆188復(fù)配不易溶于各助表面活性劑，助表面活性劑1，2-丙二醇，聚乙二醇400對(duì)各表面活性劑溶解能力較弱，均不宜用于制備微乳。異丙醇作助表面活性劑較易形成微乳且載水量大，但無水乙醇更適用于藥用載體的制備，并且可在一定范圍內(nèi)形成性質(zhì)穩(wěn)定的W/O型微乳。以大豆油為油相時(shí)，各體系不能形成微乳或形成的微乳載水量很小。因此，選擇表面活性劑氫化蓖麻油7、司盤80、大豆磷脂、司盤80和聚山梨酯80復(fù)配，助表面活性劑無水乙醇和油相肉豆蔻酸異丙酯、辛癸酸甘油酯、油酸乙酯進(jìn)一步篩選。

2.3 利用偽三元相圖篩選微乳處方：

2.3.1 表面活性劑的選擇 室溫25 ℃下，固定Km值為1：1，助表面活性劑為無水乙醇，油相為肉豆蔻酸異丙酯，以微乳相圖區(qū)域面積大小為指標(biāo)，考察氫化蓖麻油7、大豆磷脂、司盤80、司盤80和聚山梨酯80復(fù)配所形成的微乳區(qū)域大小。由圖1可知，大豆磷脂所形成微乳區(qū)域最大，氫化蓖麻油7其次，司盤80、司盤80和聚山梨酯80復(fù)配相差不大。 因此，選擇大豆磷脂為表面活性劑制備曲克蘆丁微乳。

2.3.2 油相的選擇 固定Km值為1：1，表面活性劑為大豆磷脂，助表面活性劑為無水乙醇，分別考察肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯和辛癸酸甘油酯作為油相時(shí)微乳區(qū)域大小。圖2表明，肉豆蔻酸異丙酯作為油相形成的微乳區(qū)域面積大于油酸乙酯和辛癸酸甘油酯，故選擇肉豆蔻酸異丙酯為油相進(jìn)行處方優(yōu)化。

2.3.3 溫度對(duì)微乳形成區(qū)域的影響 分別于16，25和37 ℃，以大豆磷脂/無水乙醇(Km=1：1)為混合表面活性劑，肉豆蔻酸異丙酯作為油相，繪制偽三元相圖。由圖3可知，隨著溫度的升高，微乳區(qū)域面積增大。但是37 ℃條件下制成的微乳，冷卻后常會(huì)變渾濁，且大豆磷脂對(duì)高溫敏感，無水乙醇在溫度較高時(shí)會(huì)揮發(fā)，兼顧微乳區(qū)域面積大小和微乳穩(wěn)定性，選擇室溫(25 ℃)下制備微乳。

2.3.4 表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比(Km)的選擇 25 ℃條件下，在大豆磷脂/無水乙醇/肉豆蔻酸異

圖1 4種表面活性劑的偽三元相圖

圖2 3種油相的偽三元相圖

丙酯/純化水體系中，分別采用Km為1：2，1：1，2：1和3：1制備相圖，考察Km對(duì)微乳形成的影響。從圖4看出，隨著Km值由1：2增大到2：1，微乳區(qū)域的面積呈現(xiàn)出相應(yīng)的增大，但當(dāng)Km值為3：1時(shí)微乳區(qū)面積較2：1時(shí)有所減小，目視法可觀察到此時(shí)微乳液的黏度大，極易形成粘稠的凝膠區(qū)。由于Km值為2：1時(shí)所制備的微乳既可以形成較大的微乳區(qū)域又滿足低含量表面活性劑的原則，因此最終確定Km為2：1是最佳選擇。

2.4 最優(yōu)處方及曲克蘆丁微乳的制備 根據(jù)最少表面活性劑用量的原則，結(jié)合微乳穩(wěn)定性、載藥量、制劑成本等因素考慮，選擇混合表面活性劑與油相比例為4：6，純化水加入量為此比例下最大載水量的70%，由此空白微乳處方確定為：大豆磷脂：無水乙醇：肉豆蔻酸異丙酯：雙蒸水=23.30：11.67：52.45：12.59。在制備曲克蘆丁微乳時(shí)，將其溶解于純化水中，緩慢滴加進(jìn)混和表面活性劑和油相組成的混合物中，在室溫下攪拌30 min，混勻，即得到透明的曲克蘆丁微乳。

2.5 曲克蘆丁微乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1 性狀 目視觀察制備的曲克蘆丁微乳的性狀，由圖5可見，本品為微乳制劑，常溫下為黃色、透明的澄清液體，且流動(dòng)性好。

2.5.2 曲克蘆丁微乳的鑒別

2.5.2.1 染色法 取相同體積曲克蘆丁微乳2份，置于試管中，同時(shí)各加入2滴蘇丹Ⅲ和亞甲基藍(lán)，靜置觀察擴(kuò)散情況。如圖6所示，油溶性染料蘇丹Ⅲ在微乳中的擴(kuò)散速度大于水溶性染料亞甲基藍(lán)，所制備的微乳為W/O型微乳。

2.5.2.2 電導(dǎo)率法 取同體積空白微乳、曲克蘆丁微乳、曲克蘆丁水溶液和油相(肉豆蔻酸異丙酯)，采用DDS-11AW電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率。實(shí)驗(yàn)測得空白微乳和

圖3 3種溫度下的偽三元相圖

圖4 4種Km值的偽三元相圖

圖5 曲克蘆丁微乳外觀

Fig.5 Appearance of troxerutin microemulsion

圖6 曲克蘆丁微乳類型

曲克蘆丁微乳的電導(dǎo)率值接近于油相的電導(dǎo)率值，且明顯小于曲克蘆丁水溶液的電導(dǎo)率值，故可判定此微乳為以不是良導(dǎo)體的油相為外相的W/O型微乳。

2.5.3 曲克蘆丁微乳顯微形態(tài)觀察 將曲克蘆丁微乳稀釋10倍，取適量滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜止10 min后用濾紙吸干多余液體，再滴加2%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染5 min，干燥后電鏡下觀察結(jié)果。如圖7所示，在透射電鏡下曲克蘆丁微乳乳滴為圓球形，大小分布較均勻，且滿足微乳粒徑范圍的要求。

2.5.4 微乳的粒徑分布 取3批曲克蘆丁微乳，采用馬爾文激光納米粒度儀測定其粒徑和粒徑分布。粒徑測定結(jié)果見圖8，平均粒徑為(50.20±4.05) nm，多分散指數(shù)為(0.187±0.025)，表明微乳的分布范圍較窄，粒徑大小較均勻。

圖7 曲克蘆丁微乳的透射電鏡觀察(×62 000)

Fig.7 Observation of troxerutin microemulsion under transmission electron microphotography(×62 000)

圖8 曲克蘆丁微乳的粒徑分布

Fig.8 Size distribution of troxerutin microemulsion

2.5.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取曲克蘆丁微乳10 mL，室溫放置6個(gè)月，分別在 0，1，2，3，6個(gè)月對(duì)其電導(dǎo)率、pH值、藥物含量進(jìn)行檢測，并觀察是否澄清透明、分層及藥物沉淀。如表1所示，在 0，1，2，3，6個(gè)月微乳仍維持澄清、透明，未出現(xiàn)相分層、沉淀和渾濁等現(xiàn)象，pH值、電導(dǎo)率及藥物含量變化都不大，說明制備的微乳有較好的穩(wěn)定性。

2.6 曲克蘆丁微乳的含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack ODS C18柱(4 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇：水：冰乙酸=43：57：1；流速1 mL·min-1；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.6.2 溶液制備

2.6.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取曲克蘆丁對(duì)照品約2.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得100 μg·mL-1的曲克蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.6.2.2 微乳供試品溶液 精密稱取曲克蘆丁微乳0.5 g于10 mL量瓶中，加適量甲醇搖勻破乳后，繼續(xù)滴加甲醇至刻度，超聲處理30 min，靜置后精密吸取1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，得供試液?？瞻孜⑷楣┰嚻啡芤和ㄖ苽?。

表1 曲克蘆丁微乳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

Tab.1 Stability test on troxerutin microemulsion

2.6.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取稀釋的曲克蘆丁對(duì)照品貯備液、空白微乳供試品溶液和微乳供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。觀察空白微乳中是否有物質(zhì)干擾曲克蘆丁色譜峰。結(jié)果如圖9，曲克蘆丁的測定不受空白輔料干擾，專屬性良好，保留時(shí)間為12.9 min。

2.6.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取曲克蘆丁對(duì)照品貯備液0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0，1.500 0，2.000 0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，15.000，20.000 μg·mL-1溶液，依次進(jìn)樣，記錄曲克蘆丁的峰面積，以曲克蘆丁對(duì)照品溶液的濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=24 358X-1 822.2(R2=0.999 8)，結(jié)果表明曲克蘆丁在0.625～20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.6.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取曲克蘆丁對(duì)照品溶液(5 μg·mL-1)，按“2.6.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得濃度，計(jì)算精密度。結(jié)果RSD為0.62%，說明儀器精密度良好。

2.6.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取微乳供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，計(jì)算出RSD為0.56%，結(jié)果表明曲克蘆丁微乳供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次的曲克蘆丁微乳6份，按“2.6.2.2”項(xiàng)制成供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件測定曲克蘆丁峰面積，計(jì)算得RSD為0.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取空白微乳0.5 g，3份，分別于10 mL量瓶中，再分別向其中加入曲克蘆丁對(duì)照品低、中、高濃度(0.125，0.5，1.5 mg·mL-1)1 mL，按“2.6.2.2”方法處理，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，各平行進(jìn)樣3次，計(jì)算回收率。結(jié)果如表2，本法測定低、中、高濃度的回收率均符合要求，表明本方法準(zhǔn)確度高。

2.6.4 曲克蘆丁含量測定 取3批曲克蘆丁微乳，按照“2.6.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照“2.6.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果曲克蘆丁微乳含量分別為1.13，1.09，1.07 mg·mL-1，平均為(1.10±0.03) mg·mL-1。

3 討論

通過比較偽三元相圖中微乳區(qū)域的大小，筆者選擇大豆磷脂/無水乙醇/肉豆蔻酸異丙酯/純化水作為最終處方，制備了W/O型曲克蘆丁微乳。大豆磷脂是一種非離子型表面活性劑，毒副作用較小，且具有良好的生物相容性和乳化能力，文獻(xiàn)報(bào)道大豆磷脂可以作為吸收促進(jìn)劑提高藥物的跨膜吸收[6]。單獨(dú)使用磷脂形成界面膜的剛性很大，易形成凝膠態(tài)，乙醇的加入降低了水相的極性增加界面膜的流動(dòng)性和彈性，有利于微乳的形成[7]。W/O型微乳提高水溶性藥物生物利用度主要通過促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。曲克蘆丁微乳可以提高其生物利用度有一定的理論基礎(chǔ)，藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)及體外滲透性實(shí)驗(yàn)仍在后續(xù)進(jìn)行。

綜上，曲克蘆丁作為臨床常用的抗凝血藥及溶栓藥，將其制備成W/O型微乳，性質(zhì)穩(wěn)定，粒徑大小均勻，有望改善曲克蘆丁的吸收現(xiàn)狀，提高生物利用度，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Formulation Screening and Determination of Troxerutin Microemulsion

XU Man, YU Qing, ZHAO Qianru, CHEN Wei, LIN Yuanjie, JIN Yong

(SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Objective To optimize a W/O microemulsion formulation of troxerutin and evaluate its physical properties such as morphology, droplet size, stability and content of troxerutin. Methods The W/O microemulsion was optimized using a pseudoternary phase diagram and the area of the microemulsion region was used to screen and determine microemulsion components.HPLC assay was used for determination of the loading content. Results The optimal formulation contained lecithin, ethanol, isopropyl myristate and water (23.30：11.67：52.45：12.59).The microemulsion was physicochemically stable with round shape and uniform size, and the mean droplet size was about 50.20 nm. Conclusion Microemulsion was developed successfully.It will expect to be the new preparation for troxerutin.

Troxerutin； Pseudoternary phase diagram； Microemulsion； Quality evaluation

2014-12-11

2015-01-26

*安徽省高校自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A153)

許曼(1990-)，女，安徽六安人，在讀碩士，主要從事生物藥劑學(xué)研究。電話：0564-3338512，E-mail：xuman947527836@126.com。

金涌(1969-)，男，安徽休寧人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物藥劑學(xué)和體內(nèi)藥物分析研究。電話：0551-65177769，E-mail：aydyjs@163.com。

R973.2；R927.2

B

1004-0781(2015)12-1627-06

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.020