白藜蘆醇對人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活素及p27蛋白表達(dá)的影響

涂睿，劉孝橋

(1.三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌 443000；2.湖北省宜昌市葛洲壩中心醫(yī)院腫瘤科，宜昌 430071；3.湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院兒科，宜昌 443003)

白藜蘆醇對人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活素及p27蛋白表達(dá)的影響

涂睿1，2，劉孝橋3

(1.三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌 443000；2.湖北省宜昌市葛洲壩中心醫(yī)院腫瘤科，宜昌 430071；3.湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院兒科，宜昌 443003)

目的探討白藜蘆醇(Res)對人腎細(xì)胞癌細(xì)胞存活素、p27蛋白表達(dá)的影響。方法使用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)作用人腎細(xì)胞癌786-0 細(xì)胞12，24及48 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測786-0細(xì)胞周期和凋亡情況，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細(xì)胞存活素、p27蛋白的表達(dá)情況，以空白培養(yǎng)液作為對照組。結(jié)果實(shí)驗組G1期[(64.87±3.76)%]及G2期[(9.91±0.82)%]比例顯著性降低(P<0.05)，S期[(25.05±3.12)%]比例顯著性升高(P<0.05)；實(shí)驗組在12，24和48 h等不同時間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率[(5.12±0.64)%，(5.71±0.49)%，(5.84±0.30)%]均明顯高于對照組[(0.72±0.27)%，(0.93±0.25)%，(1.12±0.21)%，P<0.05]；實(shí)驗組存活素蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達(dá)呈顯著性升高(P<0.05)；實(shí)驗組p27蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達(dá)水平呈顯著性降低(P<0.05)；實(shí)驗組細(xì)胞存活素與p27蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論Res通過抑制p27蛋白的表達(dá)而上調(diào)存活素的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的凋亡。

白藜蘆醇；癌，腎細(xì)胞；存活素；p27蛋白

白藜蘆醇(reservatrol，Res)是提取自葡萄、花生和虎杖等植物的酚類化合物，其不僅具有抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等藥理作用，而且還對包括腎癌在內(nèi)的多種腫瘤疾病具有治療作用[1-2]。存活素是一種凋亡抑制基因(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，與細(xì)胞凋亡和周期均有密切的聯(lián)系。p27則為一種抑癌基因，其蛋白在細(xì)胞周期和凋亡過程中均有所參與，對細(xì)胞周期具有明顯的負(fù)性調(diào)控作用。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，腎細(xì)胞癌是常見于泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤疾病，故本研究擬探討Res對人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活素、p27蛋白表達(dá)的影響，為其在腎細(xì)胞癌的臨床治療應(yīng)用提供實(shí)驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑及儀器 Res購自美國Sigma公司；存活素、p27單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。流式細(xì)胞儀為美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；RDY-ZY2型轉(zhuǎn)印電泳儀購自上海歐翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)方法 人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)液(內(nèi)含20%胎牛血清，1×105U·L-1青霉素、鏈霉素)，在37 ℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱里進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞周期檢測方法 取處于對數(shù)生長期的人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞，用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)培養(yǎng)處理24 h，以DMEM培養(yǎng)液作為對照組，每組需設(shè)置3個實(shí)驗復(fù)孔。離心處理后收集1×106·mL-1細(xì)胞，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌后，使用PI復(fù)合染液在避光位置染色處理20 min，采用流式細(xì)胞儀對各組細(xì)胞周期予以檢測，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測方法 取處于對數(shù)生長期的人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞，用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)培養(yǎng)處理12，24和48 h，每組需設(shè)置3個復(fù)孔。4 ℃條件下2 000 r·min-1(r=6 cm)離心處理后收集1×106·mL-1細(xì)胞，加入Annexin-V-FITC試劑在4 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，加入PI復(fù)合染液10 μL，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析。

1.6 存活素、p27蛋白表達(dá)檢測方法 采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測各組細(xì)胞存活素、p27蛋白表達(dá)水平，在94 ℃溫度條件下加熱處理10 min，然后使用分離膠對組織樣品予以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳，從凝膠組織中將蛋白質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至濾膜上，電泳轉(zhuǎn)印處理后行Western blot檢測，一抗以1：200予以稀釋處理，二抗則以1：750予以稀釋處理，采用二氨基聯(lián)苯胺染色(3,3'-diaminobenzidine,DAB)試劑盒顯色處理，如有蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)立即用大量PBS溶液沖洗以終止Western blot反應(yīng)過程，實(shí)驗結(jié)果采用專用掃描儀器分析和處理，其中存活素為16 000，p27蛋白為27 000，目的蛋白/GAPDH的灰度比值表示其蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Res對人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞周期的影響 用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)培養(yǎng)處理人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞24 h后，實(shí)驗組G1期及G2期比例顯著性降低(P<0.05)，S期比例顯著性升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞周期的比較

Tab.1 Comparison of cell cycle between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells

組別G1期S期G2期對照組75．42±4．3413．22±2．0811．30±1．33實(shí)驗組64．87±3．76?125．05±3．12?19．91±0．82?1

與對照組比較，*1P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05

2.2 Res處理不同時間對人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗組在12，24和48 h等不同時間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 兩組不同時間點(diǎn)人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率的比較

Tab.2 Comparison of apoptosis between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

組別12h24h48h對照組0．72±0．270．93±0．251．12±0．21實(shí)驗組5．12±0．64?15．71±0．49?15．84±0．30?1

與對照組比較，*1P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05

2.3 Res處理不同時間對人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活素、p27蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗組存活素蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達(dá)呈顯著性升高(P<0.05)；實(shí)驗組p27蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達(dá)水平呈顯著性降低(P<0.05)。見表3，圖2。

2.4 存活素、p27蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 實(shí)驗組細(xì)胞存活素與p27蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)。

3 討論

Res是植物受到某些因素侵害時產(chǎn)生的一種抗毒

圖1 兩組人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞不同時間點(diǎn)凋亡流式細(xì)胞圖

表3 兩組不同時間點(diǎn)人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活素、p27蛋白表達(dá)的比較

Tab.3 Comparison of the expression of survivin and p27 protein between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

組別與時間例數(shù)存活素/GAPDHp27/GAPDH對照組30 12h0．57±0．110．87±0．21 24h0．55±0．130．85±0．22 48h0．59±0．150．88±0．24實(shí)驗組27 12h0．74±0．17?10．65±0．12?1 24h0．97±0．21?1?20．51±0．08?1?2 48h1．21±0．24?1?20．42±0．07?1?2

與對照組同時間點(diǎn)比較，*1P<0.05；與本組前一時間點(diǎn)比較，*2P<0.05

Compared with control group at same time point，*1P<0.05；compared with same group at former time point，*2P<0.05

素，其藥理作用十分廣泛，除已知多種藥理作用外，還有較多實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，Res對腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等均有明顯的治療作用，但作用機(jī)制仍未研究清楚[3]。目前主要認(rèn)為Res通過對腫瘤細(xì)胞的增殖過程加以抑制，進(jìn)而使得細(xì)胞周期表現(xiàn)出明顯的易變性。國內(nèi)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞的比例顯著升高，而S期細(xì)胞比例明顯降低，最終腫瘤細(xì)胞在G1期停止[4-5]。國外實(shí)驗研究則發(fā)現(xiàn)，Res可促進(jìn)細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制蛋白WAF1/p21的表達(dá)水平，使得癌細(xì)胞在S期停止[6]。本研究采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示G1期及G2期細(xì)胞比例顯著性降低，而S期細(xì)胞比例明顯升高，與上述結(jié)果相符，且細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，由此可知Res將786-0細(xì)胞阻滯在S期，并且誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

圖2 兩組不同時間點(diǎn)人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活素、p27蛋白的表達(dá)

Fig.2 Comparison of the expression of survivin and p27 protein between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

存活素蛋白是一種IAP家族新成員，在腫瘤組織中存活素均呈異常的高表達(dá)水平，且與腫瘤疾病的預(yù)后情況有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，其不但能抑制細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，還能對細(xì)胞的有絲分裂過程予以調(diào)節(jié)，通過抑制Caspase-3、Caspase-7的生物學(xué)活性作用對細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象加以抑制，存活素表達(dá)水平增高可協(xié)助克服G2/M期檢測點(diǎn)，通過有絲分裂這種方式促進(jìn)細(xì)胞的增殖過程[7-8]。p27蛋白對細(xì)胞周期具有負(fù)性調(diào)節(jié)和控制作用，主要通過抑制CDK的生物學(xué)活性作用，使得細(xì)胞在G1期出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，抑制其進(jìn)入S期，進(jìn)而對細(xì)胞的增殖過程加以抑制，使得細(xì)胞有時機(jī)去修復(fù)已受到嚴(yán)重?fù)p傷的DNA[9]。p27蛋白表達(dá)水平下降則會減低其對CDK生物學(xué)活性作用的抑制效應(yīng)，細(xì)胞得以順利完成細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化過程，細(xì)胞增殖速度明顯增快，促進(jìn)腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗組存活素或p27蛋白表達(dá)水平明顯高(或低)于對照組，且隨時間延長表達(dá)呈顯著性升高(或降低)，且存活素與p27蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系，此結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究相符，證實(shí)存活素蛋白高表達(dá)和p27蛋白低表達(dá)與腎癌的發(fā)生、發(fā)展有密切相關(guān)性[10-11]。存活素蛋白表達(dá)的異常使得細(xì)胞凋亡抑制作用失去正?？刂?，同時p27蛋白表達(dá)水平降低，使得細(xì)胞增殖能力明顯加強(qiáng)，兩者共同發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和組織的發(fā)生及發(fā)展過程[10]。此外存活素具有細(xì)胞周期依賴性表達(dá)的生理學(xué)特性，主要在G2/M期表達(dá)，而p27能使細(xì)胞產(chǎn)生G1期阻滯，導(dǎo)致存活素表達(dá)水平明顯下降，這可能是p27下調(diào)存活素表達(dá)的主要原因[12]。由此推測，Res可通過抑制p27蛋白的表達(dá)水平而上調(diào)存活素的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的凋亡。

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Effect of Resveratrol on the Expression of Survivin and p27 Protein in Human Renal Cell Carcinoma 786-0 Cells

TU Rui1, 2, LIU Xiaoqiao3

(1.NO.3ClinicMedicineSchool,SanxiaUniversity,Yichang443000,China； 2.DepartmentofOncology,theCenterHospitalofGezhoubainYichang,Yichang430071,China； 3.DepartmentofPediatrics,theCenterPeople'sHospitalofYichang,Yichang443003,China)

Objective To investigate the effect of resveratrol (Res) on the expression of survivin, p27 protein in human renal cell carcinoma 786-0 cells. Methods The cell cycle and apoptosis of 786-0 cells were detected by flow cytometry, and the expression of survivin and p27 protein of 786-0 cells was detected by Western blotting at time point of 12, 24 and 48 h after human renal cell carcinoma 786-0 cells were cultured with Res (25 μmol·L-1) and blank medium, respectively. Results The ratio in G1phase [(64.87±3.76)%] and G2phase [(9.91±0.82)%] in the experimental group decreased significantly (P<0.05), and the ratio of S phase [(25.05±3.12)%] increased significantly (P<0.05).The apoptosis rate of experimental group at 12, 24 and 48 h [(5.12±0.64)%, (5.71±0.49)%, (5.84±0.30)%] was significantly higher than that of the control group [(0.72±0.27)%, (0.93±0.25)%, (1.12±0.21)%,P<0.05].The expression of survivin protein in experimental group was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the expression was significantly increased with time prolonging (P<0.05).The expression of p27 protein in experimental group was significantly lower than that of the control group (P<0.05), and the expression level was significantly decreased in time-dependent manner (P<0.05).There was a negative correlation between the expression of survivin and p27 protein in the experimental group (P<0.05). Conclusion Res could inhibit the expression of p27 protein and up-regulate survivin expression level, and promote the apoptosis of renal cell carcinoma 786-0 cells.

Resveratrol； Carcinoma, renal cell； Survivin； p27 protein

2014-12-06

2015-01-23

涂睿(1982-)，男，湖北宜昌人，在讀碩士，研究方向：腫瘤疾病診斷與治療。電話：(0)13477122493，E-mail：turuiyc@126.com。

R285.5；R739.9

A

1004-0781(2015)12-1572-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.006