干擾素α通過P204和RAS信號途徑誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞凋亡*

龍向淑，吳強，劉太河，宋方，黃晶，田茂波，肖燕

(1.貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽 550002；2.安順學(xué)院數(shù)學(xué)與計算機科學(xué)學(xué)院，安順 561000)

·藥物研究·

干擾素α通過P204和RAS信號途徑誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞凋亡*

龍向淑1，吳強1，劉太河2，宋方1，黃晶1，田茂波1，肖燕1

(1.貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽 550002；2.安順學(xué)院數(shù)學(xué)與計算機科學(xué)學(xué)院，安順 561000)

目的觀察干擾素-α(IFN-α)對大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)凋亡的影響，并探討其部分機制。方法將VSMCs分為A、B、C 3組，A組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，B組予IFN-α干預(yù)后轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，C組予IFN-α干預(yù)后轉(zhuǎn)染IFN誘導(dǎo)蛋白204基因(IFI204) siRNA，均培養(yǎng)至48 h收集細胞。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測IFN誘導(dǎo)蛋白204(P204) mRNA表達，Western blot檢測P204、RAS蛋白表達及RAF/ERK磷酸化變化，流式細胞儀Annexin-V FITC/PI法檢測細胞凋亡。結(jié)果與A組比較，B組P204 mRNA和蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，細胞凋亡增多(P<0.05)，伴RAS蛋白表達減少(P<0.05)，RAF/ERK磷酸化水平下降(P<0.05)；C組P204 mRNA及蛋白表達下調(diào)(P<0.05)，細胞凋亡減少(P<0.05)，RAS蛋白表達增多和RAF/ERK磷酸化水平上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論P204及RAS信號途徑參與IFN-α誘導(dǎo)大鼠VSMCs凋亡過程的調(diào)控。

干擾素；血管平滑肌細胞；干擾素誘導(dǎo)蛋白204；RAS信號途徑；凋亡

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是構(gòu)成血管壁的主要實質(zhì)細胞，各種理化刺激導(dǎo)致VSMCs過度增殖及凋亡減少是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、高血壓(hypertension，HP)及經(jīng)皮血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)后再狹窄等血管增殖性疾病(vascular proliferative diseases，VPD)發(fā)病的主要機制[1]。干擾素(interferon，IFN)是一組具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細胞增殖及促進細胞凋亡等作用的活性細胞因子家族[2-8]。IFN誘導(dǎo)蛋白204(interferon induction protein 204，P204)是IFN誘導(dǎo)P200家族的鼠類蛋白成員。研究顯示，IFN-α可誘導(dǎo)P204表達而抑制大鼠VSMCs及血管外膜成纖維細胞增殖[9-10]，但IFN對VSMCs凋亡的影響及其機制尚未完全明確。筆者在本研究中用IFN-α和(或)P204 siRNA處理大鼠原代VSMCs，觀察VSMCs凋亡變化并探討其部分機制，為IFN在VPD領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠(雄性2只，雌性1只)，約5周齡，體質(zhì)量120～140 g，第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0003。

1.2 試劑 IFN-α(批號：19990034)，購自北京三元基因工程有限公司；α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體(批號：BM0002)、免疫組化染色試劑盒(批號：SA1021)及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(批號：AR1022)購自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(批號：C1063)和Tubulin抗體(批號：AT819)購自碧云天生物技術(shù)研究所；TRNzol 總RNA提取試劑(批號：DP405)、2×Taq PCR MasterMix(批號：KT201)和100 bp DNA Ladder(批號：MD109)購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(批號：DRR047A)購自TaKaRa公司；聚合酶鏈反應(yīng)polymerase chain reaction，PCR)擴增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，具體序列如下，P204，上游：5′-TCATGGTCCC-AAACAAGTGA-3′，下游：5′-ACCCATTGCACCCAA-AATAA-3′(擴增長度200 bp)；GAPDH，上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游：5′-TCCACCA-CCCTGTTGCTGTA-3′(擴增長度452 bp)；P204抗體(批號：sc-13367)及IFI204 siRNA(批號：sc-40700)購自Santa Cruz公司；RAS(批號：ab108602)、p-RAF(批號：ab78334)及p-ERK 44/42抗體(批號：ab47339)購自Abcam公司。

1.3 主要儀器 sw-cj-1f型超凈工作臺(吳江市金家壩金太凈化設(shè)備廠)；MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO Electric 公司)；5810R型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Veriti96孔型梯度PCR儀(美國ABI公司)；DU 640型核酸蛋白分析儀(美國Backman公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；EC3 600型凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.4 細胞培養(yǎng)及實驗分組 按文獻[11]的方法培養(yǎng)VSMCs。取4～6代細胞用于實驗。將VSMCs分為A、B、C 3組，A組未加IFN-α，與B組及C組同步轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，B組予IFN-α干預(yù)后6 h轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，C組予IFN-α干預(yù)后6 h轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA，IFN終濃度為2×106U·L-1，3組干預(yù)后均培養(yǎng)至48 h收集細胞。實驗重復(fù)3次。

1.5 RT-PCR檢測mRNA表達 按Trizol 法提 取細胞總RNA，取總RNA1 μg 按RT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA產(chǎn)物3 μL進行PCR循環(huán)，PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃30 s、58 ℃30 s及72 ℃1 min，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，電泳結(jié)果采用EC3 600型凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.6 Western blot 檢測蛋白表達 收集干預(yù)后的VSMCs于離心管(eppendorf，EP)中，1 000 r·min-1(半徑=250 mm)離心5 min、去上清液后加入細胞裂解液，4 ℃冷凍，離心5 min，取上清液另置于預(yù)冷、無菌的EP管中，BCA法蛋白定量。取蛋白樣品量80 μg于0.2 mL EP管中，加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸3 min。用8%SDS-PAGE恒壓80～100 V分離蛋白，4 ℃恒流250 mA×90 min轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(poly-vinylidene fluoride，PVDF)膜上。封閉液封閉PVDF膜2 h，去除封閉液，加入按1：500稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，聚山梨酯20/TBS溶液(tris-buffered saline and tween 20，TBST)漂洗，加入按1：5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，TBST漂洗。將PVDF蛋白面朝上置于保鮮膜上，取增強化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光試劑A和B按1：1避光混合1 min，將混合液滴加至PVDF膜上，約1 min后去盡殘液，固定PVDF膜。X線膠片曝光、顯影及定影后掃描，用圖像軟件根據(jù)信號強弱對條帶進行灰度分析。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒C1063說明書操作收集細胞并染色，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)因素對P204 mRNA和蛋白表達的影響 與A組比較，B組P204 mRNA和蛋白表達增加(P<0.05)，C組P204 mRNA和蛋白表達減少(P<0.05)；與B組比較，C組P204 mRNA和蛋白表達減少(P<0.05)。見圖1。

Ⅰ.電泳圖；Ⅱ.柱形圖；與A組比較，*1P<0.05；與B組比較，*2P<0.05

圖1 3組大鼠VSMCs P204 mRNA及蛋白表達的比較(n=3)

Ⅰ.electrophotogram；Ⅱ.histogram；compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

Fig.1 Comparison of VSMCs P204 mRNA and protein expression of among three groups of rats(n=3)

2.2 干預(yù)因素對VSMCs凋亡的影響 與A組比較，B組細胞凋亡增多(P<0.05)，C組細胞凋亡減少(P<0.05)；與B組比較，C組細胞凋亡減少(P<0.05)。見圖2。

2.3 干預(yù)因素對RAS蛋白表達和RAF及ERK磷酸化p-RAF及p-ERK水平的影響 與A組比較，B組RAS 蛋白表達減少，RAF及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra-cellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化水平降低(P<0.05)，C組RAS 蛋白表達增多，RAF及ERK磷酸化水平升高(P<0.05)；與B組比較，C組RAS 蛋白表達增多，RAF及ERK磷酸化水平升高(P<0.05)。見圖3。

3 討論

VSMCs是血管壁的主要實質(zhì)細胞，炎癥、免疫反應(yīng)及剪切力等因素作用使其異常增殖及凋亡減少是AS、HP及PTA后再狹窄等VPD發(fā)生、發(fā)展的重要機制。因此，VSMCs作為“參與者”在VPD發(fā)病中起關(guān)鍵作用，研究如何有效抑制VSMCs增殖并適當(dāng)促進其凋亡對防治上述疾病至關(guān)重要。

IFN是最早應(yīng)用于臨床的基因工程藥物之一，其抗病毒、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤作用及其機制已明確[4-6，12-13]。IFN可影響跨膜信號傳遞、蛋白激酶激活、蛋白磷酸化及細胞基因表達而誘導(dǎo)細胞凋亡[2，7，13]。P204是IFN誘導(dǎo)蛋白P200家族的鼠類蛋白成員，IFN-α可誘導(dǎo)P204表達而抑制大鼠VSMCs增殖及其部分機制已明確[9]，但IFN-α對VSMCs凋亡的影響及其機制尚未完全明了。本研究顯示，IFN-α干預(yù)后P204 mRNA和蛋白表達上調(diào)，VSMCs凋亡增多，進一步證實P204表達存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的IFN-α誘導(dǎo)性，提示IFN-α可誘導(dǎo)P204表達而促進VSMCs凋亡。IFN-α除通過誘導(dǎo)P204表達而抑制VSMCs增殖外是否尚存在其他機制？RAS信號傳導(dǎo)途徑是與細胞增殖、凋亡及分化密切相關(guān)的信號途徑之一。細胞外信號刺激激活RAS，激活型RAS逐級磷酸化活化RAF及MEK，最終活化ERK而產(chǎn)生促進細胞增殖及抑制細胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。本研究表明，單純IFN-α干預(yù)可誘導(dǎo)P204 mRNA和蛋白表達上調(diào)，伴RAS蛋白表達減少，其下游蛋白RAF及ERK磷酸化水平下降，VSMCs凋亡增多；IFN-α干預(yù)后再轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA，P204 mRNA和蛋白表達下調(diào)，RAS蛋白表達增多，RAF及ERK磷酸化水平升高，VSMCs凋亡減少，顯示IFI204 siRNA對P204在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的抑制作用，RAS蛋白表達及其下游信號蛋白RAF及ERK的磷酸化水平與P204呈反向變化趨勢，提示RAS信號途徑可能參與IFN-α促進VSMCs凋亡過程的調(diào)控。

Ⅰ.電泳圖；Ⅱ.柱形圖；與A組比較，*1P<0.05；與B組比較，*2P<0.05

圖3 3組大鼠VSMCs RAS蛋白表達和RAF及ERK磷酸化水平的比較(n=3)

Ⅰ.electrophotogram；Ⅱ.histogram；compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

Fig.3 Comparison of the expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK in VSMCs among three groups of rats(n=3)

綜上所述，IFN-α可誘導(dǎo)P204表達而促進VSMCs凋亡，P204及RAS信號途徑可能參與IFN-α誘導(dǎo)大鼠VSMCs凋亡過程的調(diào)控，但P204與RAS信號途徑之間的相互作用機制有待進一步研究。

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Inducement Effect of Interferon Alpha on Apoptosis of Rat Vascular Smooth Muscle Cells via P204 and RAS Signal Pathway

LONG Xiangshu1, WU Qiang1, LIU Taihe2, SONG Fang1, HUANG Jing1, TIAN Maobo1, XIAO Yan1

(1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople’sHospital,Guiyang550002,China；2.DepartmentofInstituteofMathematicsandComputerScience,AnshunCollege,Anshun561000,China)

Objective To investigate the effect of interferon alpha (IFN-α) on apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in rats and the related mechanism. Methods The cells were divided into three group: group A, group B and group C.Group A was transfected with nonspecific siRNA, group B was intervened with IFN-α and transfected with nonspecific siRNA, and group C was intervened with IFN-α and transfected with IFI204 siRNA.All the cells were cultured for 48 h.The expression of P204 mRNA was determined by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).P204, RAS protein levels, and phosphorylation levels of RAF and ERK were analyzed by Western blotting.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin-V FITC/PI method. Results As compared with group A, the expression of P204 mRNA and protein in group B was up-regulated (P<0.05), the cell apoptosis was increased (P<0.05), in the process of the above, the expression of RAS protein was decreased (P<0.05) and the phosphorylation levels of RAF and ERK were dropped (P<0.05).In group C, the expression levels of P204 mRNA and protein were down-regulated (P<0.05), and cell apoptosis was decreased (P<0.05), the expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK were increased (P<0.05). Conclusion P204 and RAS signal pathway participates in IFN-α regulation of apoptosis of VSMCs in rats.

Interferon； Vascular smooth muscle cells； Interferon induction protein 204； RAS signal pathway； Apoptosis

2014-12-15

2015-03-05

*國家自然科學(xué)基金資助項目(81260030)；貴州省科技攻關(guān)項目(黔科合LH字[2014]7023號)

龍向淑(1977-)，女，貴州天柱人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事冠心病、心力衰竭發(fā)病基礎(chǔ)與臨床的研究。電話：(0)15285646460，E-mail：928602548@qq.com。

吳強(1969-)，男，廣東雷州人，主任醫(yī)師，博士，主要從事冠心病、心力衰竭發(fā)病基礎(chǔ)與臨床防治的研究。電話：(0)13984112269，E-mail：gzgywq@126.com。

R965；R972

A

1004-0781(2015)12-1555-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.002