產(chǎn)木聚糖酶海洋微生物的篩選與誘變育種

黃小云，林娟，林小洪，王國(guó)增，葉秀云

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350116)

0 引言

木聚糖是植物細(xì)胞壁半纖維素的主要成分，包括由β－1，4糖苷鍵形成主鏈結(jié)構(gòu)和不同的側(cè)鏈取代基，常見(jiàn)的取代基包括4－O－甲基葡萄糖醛酸(4－O－Met－Hylglucuronic)、α－阿拉伯糖(α－arabinofuranose)及O－乙?；?O－Acetyl group)等［1］．木聚糖的完全降解需要多種水解酶的協(xié)同作用［2］．木聚糖酶(EC 3．2．1．8)通過(guò)隨機(jī)切割木聚糖主鏈骨架上的β－1，4糖苷鍵產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的低聚木糖［3］，是木聚糖降解酶系中最為關(guān)鍵的酶．

木聚糖酶的來(lái)源較廣泛，包括陸地植物組織、細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物等［3］，但大部分來(lái)源于陸地，對(duì)于海洋微生物的研究還比較少．海洋微生物所產(chǎn)的酶具有突出的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì):具有顯著的耐壓、耐堿、耐鹽、耐冷和多物種等特性，這些優(yōu)越的性質(zhì)使得海洋酶資源在工業(yè)應(yīng)用和基礎(chǔ)研究等方面具有價(jià)值，從而賦予海洋微生物酶獨(dú)特的應(yīng)用前景［4］．木聚糖酶可作為食品添加劑用于改善焙烤食品的風(fēng)味［5］，在飼料中添加木聚糖酶可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能［6］，用木聚糖酶對(duì)紙漿的預(yù)處理會(huì)大大減少化學(xué)漂白劑的用量［7］．由于其在各領(lǐng)域的重要作用，選育高產(chǎn)木聚糖酶的菌株成為目前木聚糖降解菌選育研究的熱點(diǎn)．

1 材料與方法

1．1 樣品

樣品分別來(lái)自北極泥樣，福州市平潭海域的水樣和泥樣，寧德市三都澳海域的泥樣和海藻，以及鮑魚(yú)內(nèi)臟等．

1．2 培養(yǎng)基

1)初篩培養(yǎng)基:自制甘蔗渣木聚糖15 g，NH4NO35 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，瓊脂20 g，人工海水［8］1 000 mL，pH 7．0;

2)種子培養(yǎng)基:3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，人工海水1 000 mL，pH 7．0;3)基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:20 g麩皮，10 g酵母膏，人工海水1 000 mL，pH 7．0．

1．3 主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)(SW－CJ－2FD型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);生化培養(yǎng)箱(MJX－250S型，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠);恒溫氣浴搖床(DHZ－DA型，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);雙光束分光光度計(jì)(U－2910型，日立有限公司);pH計(jì)(PHS－3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)．

1．4 實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1 自制木聚糖

取粉碎過(guò)的甘蔗渣加入60 g·L－1NaOH溶液中，固液比為1∶15，100℃條件下浸泡2 h．過(guò)濾后的濾液用36% ～38%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HCl調(diào)pH值至7．0，按濾液 ∶乙醇為1∶0．8的比例(體積分?jǐn)?shù))，加入濃度為95%(體積分?jǐn)?shù))的工業(yè)酒精，所得棕褐色或棕黃色沉淀即為木聚糖．4 000 r·min－1下離心10 min得沉淀，置于75℃條件下烘干后研磨至粉末狀即可使用［9］．

1．4．2 樣品處理及木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

稱(chēng)取1．1所示的幾份樣品(海藻和鮑魚(yú)內(nèi)臟先用無(wú)菌攪拌器研磨)于無(wú)菌生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)畬?0－1、10－6、10－7和10－8這4個(gè)梯度的樣品懸液分別涂布于木聚糖酶篩選平板，將純化后的單菌落點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基上，測(cè)定透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)的大小，計(jì)算HC值．將初篩獲得的菌株在平板上活化后，轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min－1培養(yǎng)12 h，取種子液以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min－1培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液離心后取上清進(jìn)行酶活測(cè)定．

1．4．3 木聚糖酶活力測(cè)定

1．4．3．1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制1．5 μmol·mL－1木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取 0、0．20、0．25、0．30、0．35、0．40、0．45、0．50、0．60 mL木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH6．0的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液補(bǔ)至1 mL，再加入1 mL DNS，沸水浴10 min，冷卻至室溫后在540 nm測(cè)定OD值，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1．4．3．2 木聚糖酶活力測(cè)定

取0．9 mL含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))木聚糖的底物，加入0．1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，55℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后加入1 mL DNS溶液終止反應(yīng)，煮沸10 min顯色，冷卻至室溫后于540 nm測(cè)定OD值．一個(gè)酶活力單位(U)定義為每min釋放1μmol還原糖所需的酶量．

1．4．4 形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA序列分析

依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌落特征和細(xì)胞形態(tài)的鑒定［10］．菌株的分子鑒定以16SrDNA作為指標(biāo)．以基因組為模板，選用細(xì)菌通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94℃ 5 min，94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min．

1．4．5 紫外及微波誘變

吸取5 mL菌懸液(濃度為(107～108)cfu·mL－1)于裝有轉(zhuǎn)子的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，紫外誘變是將菌懸液經(jīng)紫外燈(15 W，照射距離30 cm)照射30、60、90、120、150、180、210 s，微波誘變則是將菌懸液在微波爐最小功率下分別輻照0、1、2、3、4、5、6、7 min．對(duì)菌懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e取10－5、10－6、10－7三個(gè)稀釋度涂布于篩選平板，以未誘變的菌懸液作為對(duì)照．將上述所有平板(紫外誘變的平板需避光培養(yǎng))在30℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后取出計(jì)算平板上的菌落數(shù)，繪制致死率曲線．致死率計(jì)算公式如下:

致死率(%)=(1－誘變后的菌落數(shù)/對(duì)照組的菌落數(shù))×100%．

1．4．6 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將篩選到的木聚糖酶活力提高較多的正突變菌株，連續(xù)傳代5代以上，并通過(guò)搖瓶發(fā)酵測(cè)定其產(chǎn)酶能力，選擇產(chǎn)酶能力較高且穩(wěn)定遺傳的木聚糖酶正突變株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)．

2 結(jié)果與討論

2．1 平板初篩結(jié)果

從采集的各樣品中分離到能降解木聚糖底物產(chǎn)生透明圈且菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)有差異的菌株60株(見(jiàn)表1)，其中菌株編號(hào)為B459～B663的來(lái)自福州平潭海域的水樣和泥樣;菌株編號(hào)為Y的來(lái)自鮑魚(yú)內(nèi)臟;菌株編號(hào)為Z的來(lái)自寧德三都澳海域的海藻;菌株編號(hào)為M和N的來(lái)自寧德三都澳海域的泥樣;菌株編號(hào)為MOR、BOB和BBO的是來(lái)自北極的泥樣．

表1 產(chǎn)木聚糖酶微生物的初篩結(jié)果Tab．1 The primary screening results of xylanase－producing microorganisms

2．2 發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果

對(duì)初篩得到的60株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)定木聚糖酶活力，結(jié)果顯示，有22株菌不具有產(chǎn)木聚糖酶的能力，38株菌能產(chǎn)木聚糖酶(見(jiàn)表2)．

表2 產(chǎn)木聚糖酶微生物的復(fù)篩結(jié)果Tab．2 The secondary screening results of xylanase－producing microorganisms

產(chǎn)酶能力在0～100 U·mL－1的有14株菌，100～200 U·mL－1的有5株菌;200～300 U·mL－1的有7株菌;大于300 U·mL－1的有12株菌，其中B659菌株的木聚糖酶活力最高，達(dá)到525．3 U·mL－1．

2．3 木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)初步研究

選取酶活力相對(duì)較高的6株菌(B250、B631、B659、Y6、Z3和MOR7)，對(duì)其所產(chǎn)的木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，包括最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度．實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1．由圖1可知，這6株菌所產(chǎn)的木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值均為6．0，最適反應(yīng)溫度也很相近，分別是55℃和60℃;而且酶的pH值和溫度作用范圍也都相差不大．因此，選擇產(chǎn)酶能力最高的B659菌株作為下一步研究的實(shí)驗(yàn)菌株．

圖1 反應(yīng)pH值和溫度對(duì)木聚糖酶活力的影響Fig．1 Effect of pH and temperature on xylanase activity

2．4 菌株B659的形態(tài)鑒定及16S r DNA鑒定結(jié)果

B659菌株在篩選培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)48 h，菌落呈乳白色，小而突起，表面濕潤(rùn)皺褶，邊緣圓整(圖2(a))．顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈短桿狀，隨機(jī)分散不成鏈狀，細(xì)胞中有橢圓形芽孢，位置中生(圖2(b))．經(jīng)形態(tài)觀察初步鑒定B659菌株為芽胞桿菌屬．

圖2 B659菌株的形態(tài)觀察Fig．2 The morphology of strain B659

基于BLAST分析，菌株B659的部分16S rDNA(1 510 bp)與Bacillus stratosphericus strain MCCC 1A08157(序列號(hào):JX680139)的16SrDNA一致性為99%，構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖3)，發(fā)現(xiàn)與同溫層芽胞桿菌(Bacillus stratosphericus)、嗜氣芽胞桿菌(Bacillus aerophilus)、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)和沙福芽胞桿菌(Bacillus safensis)的親緣關(guān)系最近，因此鑒定B659菌株屬于Bacillus屬．

圖3 B659菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig．3 The phylogenetic tree of strain B659

2．5 菌株B659的誘變育種

2．5．1 紫外誘變

2．5．1．1 誘變劑量的選擇

繪制B659菌株的生長(zhǎng)曲線．由圖4可知，菌株B659在10～14 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量多且生長(zhǎng)速率恒定、細(xì)胞各成分平衡增長(zhǎng)、整個(gè)菌群的生理特性比較一致［11］，因此選擇培養(yǎng)12 h的B659菌株制備菌懸液進(jìn)行誘變．

不同照射劑量所對(duì)應(yīng)的致死率如圖5所示．當(dāng)照射時(shí)間為150 s時(shí)，致死率達(dá)到了79．4%;照射時(shí)間為180 s時(shí)，致死率達(dá)到94．1%;210 s時(shí)，致死率達(dá)到了100%．致死率在70% ～80%時(shí)有利于正突變的產(chǎn)生［12］，故實(shí)驗(yàn)選用150 s作為照射劑量對(duì)菌株進(jìn)行紫外誘變處理．

圖4 B659菌株的生長(zhǎng)曲線Fig．4 The growth curve of strain B659

圖5 B659菌株的紫外誘變曲線Fig．5 The UV mutation curves of strain B659

2．5．1．2 正突變菌株的篩選

出發(fā)菌株B659在150 s的照射劑量下，經(jīng)過(guò)2輪紫外誘變?cè)诔鹾Y平板上共得到了236株菌，挑選118株菌通過(guò)搖瓶發(fā)酵測(cè)定其酶活力．結(jié)果表明，118株突變菌株中有5株菌的產(chǎn)木聚糖酶能力高于出發(fā)菌株，詳見(jiàn)表3．

表3 出發(fā)菌株與突變菌株的木聚糖酶活力比較Tab．3 The comparison of xylanase activity between the original and the mutant strain

其中G3－16菌株的產(chǎn)酶能力最高，可達(dá)到698．8 U·mL－1，比出發(fā)菌株B659提高33．0%;其次是G3－17和G3－10菌株，其產(chǎn)酶能力分別是598．5 U·mL－1和577．0 U·mL－1，較出發(fā)菌株分別提高了13．9%和 9．8%．

2．5．1．3 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將酶活提高相對(duì)較多的突變菌株G3－10、G3－16和G3－17進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)，取第1代、第3代和第5代的菌株于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，72 h后取樣測(cè)定各菌株的酶活力，結(jié)果如表4所示．由表可知，G3－16菌株雖然誘變后酶活力提高最多，但很不穩(wěn)定，到第3代時(shí)酶活力大幅度下降，甚至低于出發(fā)菌株;G3－10菌株和G3－17菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，而G3－17菌株的產(chǎn)酶能力高于G3－10菌株，因此最后確定G3－17菌株作為下一輪誘變的出發(fā)菌株．

表4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性Tab．4 Genetic stability of mutant strain

2．5．2 微波誘變

2．5．2．1 誘變劑量的選擇

本輪誘變以紫外誘變所得突變菌株G3－17作為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行微波誘變，不同劑量所對(duì)應(yīng)的致死率曲線如圖6所示．由圖6可知，出發(fā)菌株G3－17的致死率隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)而增加．在輻射時(shí)間為4 min時(shí)，致死率達(dá)到83．2%;輻射時(shí)間為5 min時(shí)，致死率達(dá)到90．1%;輻射6 min以后，致死率達(dá)到100%．本實(shí)驗(yàn)選用4 min作為輻射劑量對(duì)G3－17菌株進(jìn)行微波誘變處理．

2．5．2．2 出發(fā)菌株與正突變菌株的酶活力比較

出發(fā)菌株G3－17在4 min的輻射劑量下，經(jīng)過(guò)2輪的微波輻射后在初篩平板上共得到了183株菌，挑選92株突變菌株全部進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)定其產(chǎn)酶能力．結(jié)果表明，92株突變菌株中有6株菌的產(chǎn)木聚糖酶能力高于出發(fā)菌株G3－17，見(jiàn)表5．其中W1－40菌株的產(chǎn)酶能力最高，可達(dá)到662．8 U·mL－1，比出發(fā)菌株G3－17提高了11．6%;W1－28和 W1－41次之，分別達(dá)到了654．3 U·mL－1和646．8 U·mL－1，其余3株菌酶活提高幅度較小．

圖6 微波誘變的致死率曲線Fig．6 The lethality rate of microwave mutagenesis

表5 出發(fā)菌株與突變菌株的木聚糖酶活力比較Tab．5 The comparison of xylanase activity between the original and the mutant strain

2．5．2．3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性分析

將酶活提高相對(duì)較多的突變菌株W1－13、W1－28、W1－40和W1－41進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)，結(jié)果如表6所示．

表6 遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定Tab．6 Genetic stability of mutant strain

這4株菌中W1－13遺傳不穩(wěn)定，其它3株都具有較好的遺傳穩(wěn)定性．其中W1－40的產(chǎn)酶能力最高，達(dá)到658．2 U·mL－1，且遺傳穩(wěn)定性良好，因此確定W1－40菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象．

2．5．3 原始菌株和突變菌株的產(chǎn)酶曲線比較

把原始菌株B659和突變菌株W1－40分別接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，每隔12 h取樣測(cè)定酶活，比較2株菌的產(chǎn)酶變化，繪制產(chǎn)酶進(jìn)程曲線．由圖7可知，B659菌株和W1－40菌株的酶活都是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，在12～36 h時(shí)上升最快，72 h時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最高(B659菌株和W1－40菌株分別為517．9和645．2 U·mL－1);72 h之后可能由于木聚糖酶失活速率高于產(chǎn)酶速率，酶活力開(kāi)始下降．

圖7 B659菌株和W1－40菌株的產(chǎn)酶曲線Fig．7 Effect of incubation time on xylanase production by strain B659 and strain W1－40

3 結(jié)論

采用透明圈法從多個(gè)海洋來(lái)源的樣品中共篩到60株有透明圈的菌株，從中復(fù)篩得到38株具有產(chǎn)木聚糖酶能力的菌株，其中經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬的菌株B659產(chǎn)酶能力最高(酶活力為525．3 U·mL－1)．對(duì)菌株B659進(jìn)行紫外誘變得到遺傳穩(wěn)定且酶活提高13．9%的突變菌株G3－17，對(duì)突變菌株G3－17進(jìn)行微波誘變得到遺傳穩(wěn)定且酶活較菌株G3－17提高11．6%的突變菌株W1－40．發(fā)酵72 h時(shí)，突變菌株W1 －40的酶活力(645．2 U·mL－1)比原始菌株 B659(酶活為517．9 U·mL－1)提高24．6%．

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