水通道蛋白1對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

李 卓，王 瑤，辛 娜，田 宇，李建華，康 煒(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710077;通訊作者，E-mail:kang_wei 2008@126．com)

水通道蛋白1(aquaporin，AQP1)是一種廣泛存在于生物細(xì)胞膜上的能高效特異轉(zhuǎn)運(yùn)水的膜通道蛋白，在多種腫瘤組織中有表達(dá)［1-4］，研究表明其在腫瘤生長、侵襲及瘤周水腫的形成等方面具有重要作用［5-7］。因此，通過抑制AQP1的高表達(dá)，或許可以成為阻礙腫瘤發(fā)生發(fā)展的一種有效手段。前期研究中我們已證實(shí)乳腺癌組織中廣泛表達(dá)AQP1蛋白，提示AQP1可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［8］，但關(guān)于其在乳腺癌發(fā)病過程中的作用及具體機(jī)制目前尚不明確。在此基礎(chǔ)上，本研究采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)特異性沉默AQP1基因，轉(zhuǎn)染人MCF-7乳腺癌細(xì)胞，檢測沉默AQP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在為乳腺癌的臨床診斷和基因治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

根據(jù) GeneBank中人AQP1基因的已知序列(BC022486 2764 bp mRNA)，選擇其基因編碼區(qū)的4個(gè)19nt的寡核苷酸序列作為靶點(diǎn)，由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的cDNA模板序列，并以一條無意序列作為陰性對(duì)照。與之對(duì)應(yīng)的shRNA表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建并超純，分別命名為AQP1-shRNA1、AQP1-shRNA2、AQP1-shRNA3 和 AQP1-shRNA4(表1)，經(jīng)測序鑒定，結(jié)果正確。

表1 AQP1-shRNA序列Table 1 Sequences of AQP1-shRNA

1．2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(細(xì)胞不做任何處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染非特異性質(zhì)粒)和4個(gè)AQP1-shRNA轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)3復(fù)孔。操作按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行。每孔加入4 μg 質(zhì)粒，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換含有血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈綠色熒光，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不顯色。隨機(jī)選擇5個(gè)視野取其平均值，分別計(jì)算轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，二者比值即為細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。

1．3 qRT-PCR法檢測MCF-7細(xì)胞AQP1 mRNA的表達(dá)

轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后48 h，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以其為模板進(jìn)行real-time PCR。20 μl反應(yīng)體系:10 μl 2 × SYBR?Premix Ex TaqTM，正、反向引物(10 μmol/L)各 0．4 μl，ROXReference Dye Ⅱ 0．4 μl，cDNA 2 μl，雙蒸水 6．8 μl。各設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為:95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 3 s、60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，采用 2-ΔΔCt法［9］進(jìn)行計(jì)算 AQP1 基因的相對(duì)表達(dá)量。AQP1基因引物序列為:上游:5＇-GATCACACACAACTTCAGCAACCA-3＇，下游:5＇-TTCACGCGGTCTGTGAGGTC-3＇;內(nèi)參基因 β-actin的引物序列為:上游:5＇-TGGCACCCAGCACAATGAA-3＇，下 游:5＇-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGGA-3＇，均由TAKARA公司合成。

1．4 Western blot檢測 MCF-7細(xì)胞 AQP1和Caspase-3的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。配制12%的凝膠，取25 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)膜，封閉，TBST洗膜后分布加入兔抗人AQP1、Caspase-3抗體(1∶1 000)及β-actin抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)，采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果掃描和分析。

1．5 CCK-8法檢測MCF-7細(xì)胞增殖活性

轉(zhuǎn)染后 0，12，24，48，72 h 進(jìn)行 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活性。具體操作按試劑盒說明進(jìn)行，每組3復(fù)孔，采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值(OD450)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1．6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

培養(yǎng)48 h后，收集并計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞，重懸于結(jié)合緩沖液，分別加入FITC標(biāo)記的Annexin-Ⅴ和碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，避光室溫孵育10 min，立即上機(jī)采用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 AQP1-shRNA重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

構(gòu)建的四組AQP1-shRNA重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序證實(shí)與所設(shè)計(jì)的序列完全一致，表明靶向AQP1基因的shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，倒置相差熒光顯微鏡下觀察，其轉(zhuǎn)染效率約為50%。

2．2 轉(zhuǎn)染 AQP1-shRNA后 MCF-7細(xì)胞中 AQP1 mRNA的表達(dá)

qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，與正常對(duì)照組相比，四組shRNA中AQP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均不同程度減低，分別為0．68±0．05，0．63 ±0．04，0．47 ±0．06 和 0．29 ±0．03，表達(dá)抑制率分別為 32．37%，36．63%，53．20% 和 70．54%，其中以AQP1-shRNA4組干擾效率最高。

2．3 轉(zhuǎn)染AQP1-shRNA后MCF-7細(xì)胞中AQP1蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h，Western blot檢測結(jié)果顯示，四組shRNA處理組細(xì)胞中AQP1蛋白水平均不同程度低于正常對(duì)照組，表達(dá)抑制率分別為29．93%，31．42%，54．88% 和 72．42%，其中以 AQP1-shRNA4 轉(zhuǎn)染后AQP1蛋白水平降低最為顯著(見圖1)。

圖1 AQP1-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后AQP1蛋白表達(dá)量Figure 1 The expression level of AQP1 protein in MCF-7 cells after transfected with AQP1-shRNAs

2．4 AQP1對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響

根據(jù)qRT-PCR法和Western blot檢測結(jié)果，選擇AQP1-shRNA4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。共分為三組:正常對(duì)照組(細(xì)胞不做任何處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染非特異性質(zhì)粒)和 AQP1-shRNA4組(轉(zhuǎn)染 AQP1-shRNA4)。

2．4．1 CCK-8法檢測AQP1對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的體外增殖能力并無明顯差異。AQP1基因表達(dá)沉默后，MCF-7細(xì)胞體外增殖活性從48 h開始受到顯著抑制，與正常對(duì)照組之間具有顯著性差異(P ＜0．05，見圖2)。

圖2 AQP1對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effect of AQP1 on cell proliferation in MCF-7 cells

2．4．2 流式細(xì)胞術(shù)檢測AQP1對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，AQP1-shRNA4轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組顯著增加(27．77 ±2．82)%(P ＜0．05)，而正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間凋亡率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，分別為(15．26 ±1．06)%和(15．93 ±1．00)%(見圖3)。2．4．3 AQP1對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，AQP1-shRNA4組細(xì)胞中的Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0．05，見圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測AQP1對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of AQP1 on cell apoptosis in MCF-7 cells detected by FCM

圖4 AQP1表達(dá)沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞中Caspase-3蛋白的影響Figure 4 The protein levels of Caspase-3 in MCF-7 cells after transfected with AQP1-shRNA4

3 討論

現(xiàn)有研究表明，AQP1在前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織、細(xì)胞系及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平升高［3，10-12］，正因?yàn)?AQP1與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，目前已成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。但關(guān)于其在乳腺癌發(fā)病過程中的作用及對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長的具體影響目前國內(nèi)外尚少有報(bào)道。前期研究中，我們采用免疫組織化學(xué)法檢測了106例乳腺癌組織及20例正常癌旁組織中的AQP1表達(dá)水平，結(jié)果表明，乳腺癌組織中廣泛表達(dá)AQP1蛋白，提示AQP1可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［8］?；诖?，本研究利用RNAi技術(shù)沉默AQP1基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討AQP1在MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡中的作用，旨在為腫瘤的分子靶向治療提供新的理論依據(jù)。

RNA干擾技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)基因阻斷技術(shù)，可以特異地沉默目的基因的表達(dá)，以便快捷地研究該基因的功能［13，14］。shRNA 是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，常被用作RNA干擾沉默靶基因的表達(dá)工具［15］。本研究中，我們首先構(gòu)建了4個(gè)靶向AQP1的shRNA重組質(zhì)粒，將其分別轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，根據(jù)qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果篩選出干擾效果最佳的AQP1-shRNA4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

腫瘤細(xì)胞具有無限的復(fù)制增殖潛能，是惡性腫瘤的一個(gè)重要生物學(xué)特性。因此，降低腫瘤細(xì)胞的增殖率是治療腫瘤的有效途徑之一。本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制AQP1基因在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，CCK-8法檢測結(jié)果顯示AQP1基因表達(dá)沉默后，隨著AQP1表達(dá)量的減少，MCF-7細(xì)胞增殖能力隨之受抑。應(yīng)用AnnexinⅤ FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染AQP1-shRNA后MCF-7細(xì)胞的凋亡率顯著升高。此外，采用Western blot法檢測細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性分子Caspase-3，結(jié)果顯示AQP1沉默后 MCF-7細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平升高。這就提示水通道蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，阻斷AQP1，腫瘤細(xì)胞的增殖速度會(huì)迅速減慢，并會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步探索。

綜上，本研究通過 RNA干擾試驗(yàn)證實(shí)沉默MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中的AQP1基因，可以有效抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示AQP1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，有望成為乳腺癌分子治療的潛在靶標(biāo)。

［1］Endo M，Jain RK，Witwer B，et al．Water channel(aquaporin 1)expression and distribution in mammary carcinomas and glioblastomas［J］．Microvasc Res，1999，58(2):89-98．

［2］Kang BW，Kim JG，Lee SJ，et al．Expression of aquaporin-1，aquaporin-3，and aquaporin-5 correlates with nodal metastasis in colon cancer［J］．Oncology，2015，88(6):369-376．

［3］Xie Y，Wen X，Jiang Z，et al．Aquaporin 1 and aquaporin 4 are involved in invasion of lung cancer cells［J］．Clin Lab，2012，58(1-2):75-80．

［4］Saadoun S，Papadopoulos MC，Davies DC，et al．Increased aquaporin 1 water channel expression in human brain tumours［J］．Br J Cancer，2002，87(6):621-623．

［5］Deb P，Pal S，Dutta V，et al．Correlation of expression pattern of aquaporin-1 in primary central nervous system tumors with tumor type，grade，proliferation，microvessel density，contrast-enhancement and perilesional edema［J］．J Cancer Res Ther，2012，8(4):571-577．

［6］Esteva-Font C，Jin BJ，Verkman AS．Aquaporin-1 gene deletion reduces breast tumor growth and lung metastasis in tumor-producing MMTV-PyVT mice［J］．FASEB J，2014，28(3):1446-1453．

［7］孟肖利，陳勁草，王正峰，等．AQP-1在星形細(xì)胞瘤及瘤周水腫組織中的表達(dá)及其意義［J］．中國臨床神經(jīng)外科雜志，2007，12(4):211-213．

［8］李卓，康煒，劉凱歌，等．水通道蛋白1與乳腺癌組織微血管生成的關(guān)系［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42(9):732-734．

［9］Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method［J］．Methods，2001，25(4):402-408．

［10］牛文斌，王春玲，秦迎春，等．TSP1與AQP1在前列腺癌中的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系［J］．中國老年學(xué)雜志，2010，30(24):3797-3798．

［11］Otterbach F，Callies R，Adamzik M，et al．Aquaporin 1(AQP1)expression is a novel characteristic feature of a particularly aggressive subgroup of basal-like breast carcinomas［J］．Breast Cancer Res Treat，2010，120(1):67-76．

［12］Gao C，Tang J，Li R，et al．Specific inhibition of AQP1 water channels in human pulmonary microvascular endothelial cells by small interfering RNAs［J］．J Trauma Acute Care Surg，2012，72(1):150-161．

［13］Gaynor JW，Campbell BJ，Cosstick R．RNA interference:a chemist’s perspective［J］．Chem Soc Rev，2010，39(11):4169-4184．

［14］萬志紅，王宇明．基因功能研究新途徑-RNA干擾［J］．世界華人消化雜志，2004，12(4):212-214．

［15］McIntyre GJ，Arndt AJ，Gillespie KM，et al．A comparison of multiple shRNA expression methods for combinatorial RNA［J］．Genet Vaccines Ther，2011，9(1):9-19．