小鼠Sema3A基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

（1.遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所口腔正畸學(xué)研究室，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，沈陽(yáng) 110002；2.遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所口腔頜面外科學(xué)研究室，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，沈陽(yáng) 110002）

小鼠Sema3A基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

閻秀林1，陳鈺文1，金婕1，朱玉1，王健1，張揚(yáng)1，盧利2

（1.遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所口腔正畸學(xué)研究室，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，沈陽(yáng) 110002；2.遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所口腔頜面外科學(xué)研究室，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，沈陽(yáng) 110002）

目的構(gòu)建小鼠Sema3A基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體。方法通過(guò)體外合成小鼠全長(zhǎng)Sema3A cDNA，采用Gateway技術(shù)將其基因插入到pDown-mSema3A-IRES/EGFP質(zhì)粒中，再交換重組獲得重組質(zhì)粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGFP，經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定后，包裝與濃縮慢病毒載體pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3A-IRES/EGFP，最后重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得病毒液。結(jié)果重組慢病毒載體11 538 bp，測(cè)序結(jié)果證實(shí)Sema3A基因共2 319 bp正確插入帶有EGFP的載體中，成功構(gòu)建小鼠Sema3A基因過(guò)表達(dá)載體。結(jié)論成功構(gòu)建小鼠慢病毒載體pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3A-IRES/EGFP，為該基因在特定細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)株的篩選奠定基礎(chǔ)。

Sema3A；慢病毒載體

正畸牙移動(dòng)離不開(kāi)張力側(cè)牙槽骨增生為主和壓力側(cè)牙槽骨吸收為主的骨改建過(guò)程，而這一過(guò)程中如何維持成骨過(guò)程與破骨過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡的骨穩(wěn)態(tài)十分重要。在骨組織改建的過(guò)程中，一些細(xì)胞因子和分泌蛋白通過(guò)作用于成骨或者破骨的不同環(huán)節(jié)而具有一定的骨保護(hù)功能，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β［1］、胰島素樣生長(zhǎng)因子1［2］、心肌營(yíng)養(yǎng)素1［3］和干擾素γ［4］等通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移與分化或者抑制破骨細(xì)胞的生成與分化而發(fā)揮骨保護(hù)作用。參與免疫和神經(jīng)元功能調(diào)節(jié)等多向調(diào)節(jié)功能的Semaphorin家族的3A（Sema3A）［5，6］在骨改建的過(guò)程中從時(shí)間上和空間上精確調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能，既能抑制破骨細(xì)胞的骨吸收效應(yīng)又能增加成骨細(xì)胞的骨形成效應(yīng)。Sema3A因其這一獨(dú)特的維持骨穩(wěn)態(tài)的功能而倍受矚目［7，8］。

Sema3A是一種分泌蛋白，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物Semaphorin家族蛋白，其對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的作用已經(jīng)得到了廣泛而深入的研究［9］。然而近年來(lái)，學(xué)者們才發(fā)現(xiàn)Sema3A還介導(dǎo)免疫調(diào)控［10］、心血管內(nèi)皮的形成［11］、癌癥的發(fā)展和骨組織的改建［5，6］等一系列生理和病理過(guò)程。Sema3A蛋白通過(guò)其特異受體Nrp1在成骨細(xì)胞中以及細(xì)胞間質(zhì)中表達(dá)，對(duì)于其是否在牙周膜、牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)中表達(dá)，目前尚無(wú)相關(guān)研究。本研究擬構(gòu)建Sema3A基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體，為研究Sema3A在正畸牙移動(dòng)骨改建的信號(hào)通路中的作用機(jī)制提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑：pUp-TRE，PLV/Des2-Neo，PLV/ helPer-SL3，PLV/helPer-SL4，PLV/helPer-SLS，dNTP，Taq酶（廣州賽業(yè)）；BP clonaseⅡPlus Enzyme Mix和LR clonaseⅡPlus Enzyme Mix，Stbl3細(xì)菌，239T細(xì)胞，Lipofectamine2000，無(wú)血清OPti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)液（Invitrogen）；高糖DMEM，PBS，F(xiàn)BS（Hyclone）；卡那霉素，氯霉素，氨節(jié)西林，胰蛋白酶（Gibco）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Qiagen）。

1.1.2 主要儀器：超凈臺(tái)，PCR儀，電泳儀與電泳槽，恒溫培養(yǎng)箱，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，高速離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 attB-mSema3A聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的獲得：根據(jù)Gateway技術(shù)要求及pcDNA-mSema3A基因特點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有attB重組位點(diǎn)的引物（引物由廣州賽業(yè)生物科技有限公司合成）。上游引物：attB1 Kozak mSema3A的5′端序列5′-GGTGGCAGCCTGCTTTTT TGTACAAACTTG-3′，下游引物：attB2 mSema3A的3′端反向互補(bǔ)序列5′-ACCCAGCTTTCTTGTACAAA GTGG-3′。PCR反應(yīng)擴(kuò)增帶有attB重組位點(diǎn)的mSema3A開(kāi)放閱讀框架全長(zhǎng)序列。純化PCR產(chǎn)物：使用Qiagen瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)attB-mSema3A的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。

1.2.2質(zhì)粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP構(gòu)建：使用BP反應(yīng)將兩端帶有attB重組位點(diǎn)的mSema3A插入已有載體的質(zhì)粒pDown-MCS-IRES/eGFP中，構(gòu)建質(zhì)粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP。（1）在室溫中按照以下成分加入到1.5 mL EP管中，包括pDown-MCS-IRES/eGFP質(zhì)粒，150 ng；attB-mSema3A PCR產(chǎn)物，150 ng；TE緩沖液至8 μL，混勻。（2）冰上溶解Bp clonaseⅡenzyme mix 2 min，短暫漩渦2次。（3）在步驟（1）混勻的反應(yīng)樣品中加入2 μL Bp clonaseⅡenzyme mix，短暫漩渦混勻2次，短暫離心。（4）25℃孵育2 h。（5）加入1 μL蛋白酶K終止反應(yīng)，37℃孵育10 min。（6）將BP產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP1O中，分別涂2塊LB平板，一塊含有卡那霉素，另一塊含有卡那霉素和氯霉素。

1.2.3 質(zhì)粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP的篩選與鑒定：LB瓊脂糖培養(yǎng)基篩選后，選擇陽(yáng)性單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序。

1.2.4 重組質(zhì)粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/ EGFP構(gòu)建：使用LR clonase將mSema3A-IRES/EGFP交換到目的載體PLV/Des2-puro中，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLV（Exp）-puro-mSema3A-IRES/EGFP。（l）在室溫中按照以下成分加入到1.5 mL EP管中，質(zhì)粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP，5 fmol；pLV.Des3d.P/ Puro，5 fmol；LR clonaseTMⅡPlus Enzyme Mix，1 μL；TE緩沖液補(bǔ)至5 μL，混勻；25℃LR反應(yīng)16 h。加入蛋白酶K，37℃終止反應(yīng)10 min。轉(zhuǎn)化LR反應(yīng)產(chǎn)物到大腸桿菌Stbl3，從轉(zhuǎn)化的平板挑取陽(yáng)性克隆搖菌并小量提取質(zhì)粒pLV（Exp）-puro-mSema3AIRES/EGFP。酶切，PCR鑒定重組質(zhì)粒，送交陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.5 大提質(zhì)粒：采用質(zhì)粒大量抽提試劑盒（德國(guó)Qiagen），制備高純度質(zhì)粒pLV（Exp）-puro-mSema3AIRES/EGFP。

1.2.6慢病毒載體pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3AIRES/EGFP的包裝與濃縮

1.2.6.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 轉(zhuǎn)染前1 d，接種5×106個(gè)293T細(xì)胞到12個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，從上述培養(yǎng)皿中去除培養(yǎng)液，加入5 mL新鮮的含10%血清DMEM培養(yǎng)液。

1.2.6.2 制備DNA－Lipofectamine2000復(fù)合物（以一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿的用量為標(biāo)準(zhǔn)）取一支無(wú)菌的2 mL離心管，加入1.5 mL無(wú)血清Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)液、PLV/helPer-SL3、PLV/helPer-SL4、PLV/helPer-SLS和pLV（Exp）-puro-mSema3A-IRES/EGFP（各3 μg），輕輕顛倒混勻。取另外一支無(wú)菌的5 mL離心管，加入1.5 mL無(wú)血清Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)液和36 μL的Lipofectamine2000，輕輕顛倒混勻。室溫孵育5 min。5 min后，將已稀釋DNA加入到含有Lipofectamine2000的無(wú)血清Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)液，輕輕顛倒混勻。室溫孵育20 min。

1.2.6.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將DNA－Lipofectamine2000復(fù)合物加到293T細(xì)胞中，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過(guò)夜。轉(zhuǎn)染后第1天，更換10 mL新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h，收集病毒液放置4℃，加入新鮮的10 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。收集72 h病毒后，3 000 r/m低速離心，過(guò)濾。50 000 g高速離心，沉淀病毒顆粒。加入新鮮培養(yǎng)液溶解病毒顆粒，獲得濃縮病毒液，分裝，-80℃保存。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP陽(yáng)性克隆的測(cè)序與鑒定

質(zhì)粒pDown-mSema3A-IRES/EGFP陽(yáng)性克隆測(cè)序由廣州賽業(yè)基因技術(shù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。測(cè)序圖見(jiàn)圖1。

圖1 pDown-mSema3A-IRES/EGFP陽(yáng)性克隆測(cè)序圖Fig.1 DNA sequencing chromatogram of positive clone of plasmid pDown-mSema3A-IRES/EGFP

2.2 重組質(zhì)粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/ EGFP陽(yáng)性克隆的測(cè)序與鑒定

重組質(zhì)粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/ EGFP陽(yáng)性克隆測(cè)序由廣州賽業(yè)基因技術(shù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。測(cè)序圖見(jiàn)圖2。

圖2 pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGFP陽(yáng)性克隆測(cè)序圖Fig.2 DNA sequencing chromatogram of positive clone of plasmid pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGF

2.3 慢病毒載體圖

慢病毒載體圖見(jiàn)圖3。

2.4 Lenti-CMV-Sema3A-IRES-eGFP-PGK-Puro的包裝

慢病毒包裝前（圖4）、包裝24 h（圖5）和48 h（圖6）的293T細(xì)胞。

3 討論

圖3 慢病毒載體圖Fig.3 Lentiviral vector map

圖4 慢病毒包裝前的293T細(xì)胞 ×100Fig.4 293T cells before packaging of lentiviral vectors×100

圖5 慢病毒包裝24 h的293T細(xì)胞Fig.5 293T cells after 24 h packaging of lentiviral vectors

圖6 慢病毒包裝48 h的293T細(xì)胞Fig.6 293T cells after 48 h packaging of lentiviral vectors

正畸牙移動(dòng)的過(guò)程中存在著明顯的骨改建過(guò)程，牽張側(cè)成骨和壓力側(cè)破骨保持著一種動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)對(duì)于骨改建相關(guān)因子的研究可以明確正畸牙移動(dòng)的分子生物學(xué)機(jī)制，從而促進(jìn)正畸牙安全、高效的移動(dòng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Sema3A-/-小鼠和Nrp1 Sema3A-/-的小鼠均顯示異常的骨和軟骨發(fā)育，以及嚴(yán)重的骨量喪失的表型。這些研究表明Sema3A-Nrp1復(fù)合體在骨改建的過(guò)程中具有明確的骨保護(hù)作用［5，6］。因此如果能獲得特定細(xì)胞Sema3A的過(guò)表達(dá)株，可以為下一步Sema3A與骨改建關(guān)系的體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

本研究選擇目前先進(jìn)的Gateway技術(shù)來(lái)構(gòu)建載體，在不使用限制性?xún)?nèi)切酶、不進(jìn)行連接的情況下，大大地簡(jiǎn)化了基因克隆的步驟，提高了克隆效率，并且保持目的基因的方向及閱讀框，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。本實(shí)驗(yàn)未對(duì)質(zhì)粒pDown-mSema3A-IRES/ EGFP行酶切后PCR鑒定，僅僅最后對(duì)重組質(zhì)粒pLV/EXPNZ-puro-mSema3A-IRES/EGFP進(jìn)行了一次酶切鑒定加以驗(yàn)證，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。

本研究選擇的慢病毒載體區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒，是以HIV-1為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的病毒載體，可以有效的感染分裂期和非分裂細(xì)胞，并且感染效率非常高，是傳統(tǒng)方法的數(shù)倍甚至數(shù)十倍［12］。本研究選擇的基因?yàn)樾∈笕L(zhǎng)mSema3A編號(hào)為NM_ 009152.4，共2 319個(gè)堿基，慢病毒包裝載體以慢病毒啟動(dòng)子CMV為載體啟動(dòng)子，所攜帶的基因mSema3a能夠整合到幾乎所有小鼠細(xì)胞基因組中，并且長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)能夠隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。同時(shí)載體內(nèi)還導(dǎo)入EGFP作為基因整合成功的熒光指示劑，因此成為研究外源基因?qū)胄∈蠹?xì)胞和小鼠體內(nèi)的有力工具。

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（編輯陳姜）

Construction and Identification for Over-expressing LentiviralVectorof mSema3A

YAN Xiu-lin1，CHENYu-wen1，JINJie1，ZHUYu1，WANGJian1，ZHANGYang1，LULi2
（1.DepartmentofOrthodontics，SchoolofStomatology，China MedicalUniversity，Shenyang 110002，China；2.DepartmentofOraland MaxillofacialSurgery，Schoolof Stomatology，China MedicalUniversity，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo construct and identify over-expressing lentiviral vector of mSema3A.MethodsSema3A gene of mice was amplified by PCR，then the gene was inserted into plasmids pDown-mSema3A-IRES/EGFP by Gateway technology.The plasmids pLV/EXPNZ-puro-mSema3AIRES/EGFP were produced by recombination.After sequencing identification，the vector pLV（Exp）-Puro-CMV-mSema3A-IRES/EGFP was packed and condensed.Finally the recombinant vectors were used to transfect 293T cells to obtain virus pools.ResultsThe recombinant lentiviral vectorswere 11 538 bp with EGFP marker，and Sema3A genes were inserted into the lentiviralvectorcorrectly，indicating the over-expressing vector of Sema3A gene in mice was successfully constructed.ConclusionThe over-expressing lentiviral vector of mSema3A was constructed correctly，which lay a foundation ofscreening ofover-expressing strains ofsuch gene in specific cells.

Sema3A；lentiviral vector

R783.5

A

0258-4646（2015）03-0226-05

遼寧省科技廳（2012225015）

閻秀林（1974-），女，副教授，博士.

張揚(yáng)，E-mail：zhangyangcmu@yahoo.com.cn

2014-12-16

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