楊 希,劉伶文,王璐倩,陳飛宇,沈苗苗,蒲峻毅
(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安710048)
黃芩是歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,屬唇形科.黃芩中具有明顯藥理作用的是黃芩苷(含量大于10%)和黃芩素(約1%)[1],具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用[2].藥物代謝研究[3]發(fā)現(xiàn),黃芩苷在腸道內(nèi)難以被直接吸收,轉(zhuǎn)化為黃芩素才能被血液吸收而發(fā)揮作用.同時(shí),大量臨床藥效試驗(yàn)[3]證明,黃芩素的藥理作用強(qiáng)于黃芩苷.
黃芩苷分子中含有葡萄糖醛酸鍵,水解難度大.化學(xué)水解法能耗高,污染大,收率低.Morimoto S[4]等從黃芩的愈傷組織中分離出內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶,最佳反應(yīng)pH為7.0~8.0;李建華等[5]研究發(fā)現(xiàn)水溫50℃浸泡處理時(shí),黃芩內(nèi)源酶降解黃芩苷的活性最強(qiáng),但是對(duì)黃芩進(jìn)行炮制處理后,黃芩內(nèi)源轉(zhuǎn)化酶被滅活,無(wú)法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化;賀美等[6]采用米曲霉活化法,轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素,轉(zhuǎn)化率達(dá)到40.72%;陳斌[7]利用藍(lán)藻體系轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素,為制備黃芩素尋找到一個(gè)新的途徑;劉伶文等[8]采用人體腸道菌轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素.目前,微生物發(fā)酵技術(shù),反應(yīng)溫和,無(wú)污染,轉(zhuǎn)化率較高,選用微生物進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素,是制備黃芩素的一個(gè)新方向.由于白腐真菌能分泌多種酶,且嗜酸真菌還能產(chǎn)生多種糖苷酶[9],因此本實(shí)驗(yàn)采用白腐真菌對(duì)黃芩苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化,期望得到黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素的一個(gè)生物模型.
黃芩苷(西安小草植物科技有限公司),黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品(98%陜西省食品藥品檢驗(yàn)所),白腐真菌(中科院成都生物研究所),市售新鮮馬鈴薯,葡萄糖,甲醇(95%,色譜純),聚酰胺薄膜展層(10cm×10cm).
分析用高效液相色譜儀(Agilent Technologies-1200series),C18色譜柱(250mm×4.6mm),HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱(杭州匯爾儀器),超凈工作臺(tái),高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R),SK5200LH超聲波儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司),752N紫外可見(jiàn)分光光度儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司).
采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基[10].新鮮土豆洗凈去皮,切成小塊,稱取200g,加蒸餾水煮爛,用4層紗布過(guò)濾,加入葡萄糖20g,繼續(xù)加熱,攪拌混勻,得1 000mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基.0.1MPa,110℃條件下滅菌20min,自然冷卻.
1.4.1 生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法 為了探索底物黃芩苷的存在是否可以誘導(dǎo)白腐真菌產(chǎn)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)化酶,設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確稱取黃芩苷1.0g加入到經(jīng)滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中,選取長(zhǎng)勢(shì)均勻良好的白腐真菌平板培養(yǎng)基,使用直徑10mm的打孔器在無(wú)菌條件下接入5片直徑為10mm的白腐真菌菌餅,放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)80h[11].
1.4.2 靜態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法 按照1.4.1中的接種方法,無(wú)菌條件下向已滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中接入5片直徑為10mm的白腐真菌菌餅,待菌株活化后,高速冷凍離心收集菌體,洗滌后將菌體懸浮于磷酸緩沖液中,再加入1.0g黃芩苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,培養(yǎng)時(shí)間為80h.
1.4.3 破壁處理 培養(yǎng)完成后,進(jìn)行超聲波破壁處理,頻率為40kHz,時(shí)間為20min.
1.4.4 白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷轉(zhuǎn)化模型對(duì)照實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)如表1所示.
1.5.1 TLC法快速檢測(cè)黃芩素 以黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,取實(shí)驗(yàn)樣品在聚酰胺薄膜展層上進(jìn)行定性分析.
聚酰胺薄膜展層劑:95%乙醇∶36%乙酸=2∶1(體積比),顯色劑:2%FeCl3乙醇溶液[12].
1.5.2 HPLC檢測(cè) 精確稱取黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品0.02g,溶解于1mL甲醇,配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液,待測(cè).將以上各組培養(yǎng)液分別于10 000r/min下離心10min,取上清液濃縮,然后用甲醇定容到30mL,再次離心后取上清液待檢測(cè).色譜條件:流動(dòng)相∶甲醇∶水∶磷酸=65∶35∶0.2(體積比),流速:1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)275nm,進(jìn)樣量10μL[13].
表1 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)Table 1 Design of experimental method
對(duì)選定的轉(zhuǎn)化模型中微生物培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得對(duì)黃芩苷的最大轉(zhuǎn)化效率,選用生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法進(jìn)行實(shí)驗(yàn).
1.6.1 最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間的確定 固定菌液量為1mL,黃芩苷量為1.0g,分別在0,12,24,36,48,60,72,84,96,108,120,132,144h條件下發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37℃.培養(yǎng)完成后離心取上清液.采用吸光光度法在波長(zhǎng)275nm下測(cè)定其吸光度值,以確定黃芩苷的最佳轉(zhuǎn)化效率時(shí)間.
1.6.2 最佳接種量的確定 固定黃芩苷量為1.0g,培養(yǎng)時(shí)間為80h.選取長(zhǎng)勢(shì)均勻良好的白腐真菌平板培養(yǎng)基,使用直徑為10mm的打孔器進(jìn)行接種.分別接入1,2,3,4,5片菌餅進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37℃.培養(yǎng)完成后離心取上清液.采用吸光光度法在波長(zhǎng)275nm下測(cè)定其吸光度值,以此來(lái)確定一定量黃芩苷所需的最佳接種量.
1.6.3 最佳pH的確定 白腐真菌適應(yīng)于微酸性環(huán)境,分別設(shè)置培養(yǎng)基pH為3.5,4.5,5.5,6.5.固定黃芩苷的量為1g,依據(jù)1.6.1和1.6.2所確定的最佳時(shí)間和接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng).培養(yǎng)完成后離心取上清液.采用吸光光度法在波長(zhǎng)275nm下測(cè)定其吸光度值,以此來(lái)確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳pH.
2.1.1 TLC法檢測(cè)結(jié)果 按照1.4.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),用TLC法快速檢測(cè)黃芩素,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.
由圖1可見(jiàn),B組實(shí)驗(yàn)液在黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)位置具有明顯斑點(diǎn),A組出現(xiàn)微弱斑點(diǎn),且顏色一致,為藥典描述的棕黑色,C組在相應(yīng)位置也出現(xiàn)明顯斑點(diǎn),但顏色為墨綠色,不符合藥典描述,即C組產(chǎn)物并非純品黃芩素.由此可初步確定白腐真菌能夠?qū)ⅫS芩苷轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物黃芩素.
2.1.2 HPLC檢測(cè)結(jié)果 按照1.4.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用HPLC對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析.各組實(shí)驗(yàn)的液相色譜圖如圖2所示.黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間約為7.304min.
圖1 轉(zhuǎn)化液TLC圖譜Fig.1 Result of TLC analysis
圖2 各組液相色譜圖Fig.2 Result of HPLC analysis of each group
A組實(shí)驗(yàn)采用的是生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法,但是未經(jīng)過(guò)超聲波處理,在相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)只檢測(cè)到極其微量的黃芩素.生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法直接將黃芩苷加入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,在白腐真菌自身生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,由于培養(yǎng)基為白腐真菌生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此其在黃芩苷的誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生新的酶.由于未經(jīng)過(guò)超聲波破壁處理,相應(yīng)的胞內(nèi)酶沒(méi)有完全釋放出來(lái),因此無(wú)法收獲大量的黃芩素.
B組實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法,經(jīng)過(guò)超聲波破壁,在7.199min處檢測(cè)到黃芩素,說(shuō)明白腐真菌經(jīng)生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法可以轉(zhuǎn)化黃芩苷,且經(jīng)超聲波破壁后得到黃芩素.按照細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法,黃芩苷被加入到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中可能產(chǎn)生相應(yīng)的酶,參照A組實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該酶應(yīng)為胞內(nèi)酶.
C組、D組實(shí)驗(yàn)均采用靜態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法,培養(yǎng)基中沒(méi)有黃芩苷,即使經(jīng)超聲波處理也不能得到黃芩素.說(shuō)明靜態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法不能為白腐真菌提供充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也沒(méi)有誘導(dǎo)其產(chǎn)生相應(yīng)的酶,因此未能將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素.
綜上所述及2.1.1結(jié)果,可確定生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法配合超聲波破壁可轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素.
在以上確定的轉(zhuǎn)化模型基礎(chǔ)上,探討培養(yǎng)條件.不同培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響如圖3所示.由圖3(a)可知,0~96h黃芩素含量不斷增加,在96h達(dá)到峰值,此后趨于平衡.白腐真菌在0~96h之間經(jīng)歷了適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期,菌絲體逐漸生長(zhǎng)累積,產(chǎn)酶量增加,黃芩素的產(chǎn)量也逐漸增加.此后到達(dá)衰亡期,菌絲體開(kāi)始凋亡,轉(zhuǎn)化過(guò)程基本停滯,黃芩素產(chǎn)量趨于平衡.因此可選擇96h作為白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素的最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間.
由圖3(b)可知,接種量在1~4片之間時(shí)黃芩素含量不斷增加,此后趨于平衡且伴有下降趨勢(shì).接種量在1~4片之間時(shí)隨著接種量增加,產(chǎn)酶量增加,黃芩素產(chǎn)量隨之增加,當(dāng)達(dá)到5片時(shí),由于培養(yǎng)基已不能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),菌絲體生長(zhǎng)受到影響,產(chǎn)酶量下降,黃芩素產(chǎn)量趨于平衡且伴有輕微下降趨勢(shì).因此可確定當(dāng)料液比為1∶100時(shí)所需菌的最佳量為4片直徑為10mm的菌餅.
圖3 培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 The influence of culture conditions on the conversion efficiency
由圖3(c)可知,pH在3.5~5.5之間時(shí)黃芩素的含量不斷增加,大于5.5以后開(kāi)始下降.白腐真菌的適宜生長(zhǎng)環(huán)境是酸性環(huán)境,在pH 3.5~5.5之間時(shí),菌絲體生長(zhǎng)良好,產(chǎn)酶量增加,黃芩素產(chǎn)量也逐漸增加,當(dāng)pH大于5.5以后,菌絲體的生長(zhǎng)代謝受到影響,產(chǎn)酶量下降,黃芩素產(chǎn)量隨之下降.因此可確定白腐真菌轉(zhuǎn)化黃芩苷生成黃芩素的的最佳pH為5.5.
(1)生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法可以誘導(dǎo)菌種表達(dá)特定的代謝酶,易于生物轉(zhuǎn)化.而靜態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及底物的刺激,一般只表達(dá)組成性酶,不會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)性酶.此外,破壁后才檢測(cè)到大量黃芩素.由此推論在轉(zhuǎn)化中起作用的酶應(yīng)屬于誘導(dǎo)酶、胞內(nèi)酶.
(2)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探究,得知最佳溫孵時(shí)間為96h,最佳pH為5.5,料液比為1∶100時(shí)所需菌的最佳量為4片直徑為10mm的菌餅.
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