土壤修復過程中微生物數(shù)量、酶活性與石油降解率的關(guān)系

張秀霞，武海杰，白雪晶，郭云霞，張守娟

（中國石油大學 環(huán)境與安全工程系，山東 青島 266580）

石油開采、運輸、儲存和利用造成的土壤石油污染日益嚴重。目前，土壤石油污染的處理方法主要有物理法、化學法以及生物修復法，其中，生物修復方法因處理徹底、費用低而備受關(guān)注［1］。微生物能夠利用石油烴作為生長所需的碳源和能源，并在酶的催化下將其水解為甘油、脂肪酸，最終降解為 H2O、。徐金蘭等［3－4］研究表明，生物修復過程中，高效石油降解菌的投加可加快石油污染物的降解，遠遠高于只有土著微生物的自然狀態(tài)的石油降解。

當高效降解菌應用于石油污染土壤時，由于營養(yǎng)物質(zhì)、空間以及代謝產(chǎn)物（如表面活性劑）而與土著微生物產(chǎn)生協(xié)同或競爭作用，直接導致微生物數(shù)量增加或減少，從而影響石油降解效率。張甲耀等［4－8］研究表明，微生物數(shù)量、土壤酶活性均與石油污染物的降解有一定關(guān)系。筆者在單因素花盆實驗優(yōu)化降解條件的基礎(chǔ)上，在花盆中投加高效石油降解菌，模擬原位修復石油污染土壤，研究微生物（細菌、真菌和放線菌）數(shù)量、土壤酶活性與石油降解率之間的相關(guān)性，為石油污染土壤的生物修復提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料

供試土壤采自新疆克拉瑪依油田的重油九區(qū)大壩附近的石油污染土壤。其pH值為7.2～7.4，含水率（質(zhì)量分數(shù)，下同）22.35%～25.28%，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)122～152g/kg，全氮質(zhì)量分數(shù)18～25g/kg，有效磷質(zhì)量分數(shù)12.0～21.6g/kg，石油烴質(zhì)量分數(shù)4.07%～5.03%。實驗過程中，供試土壤去除植物殘體以及礫石，過3mm篩，經(jīng)過自然風干7d后使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效降解菌降解條件的優(yōu)化

在恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中花盆實驗模擬微生物原位修復，將高效降解菌應用于石油污染土壤的修復。根據(jù)石油降解率對微生物的降解條件進行優(yōu)化得出，最佳接種量為15%（質(zhì)量分數(shù)）、表面活性劑（吐溫80）質(zhì)量分數(shù)為0.1%、CNP比為100∶10∶1（即有機質(zhì)含量與全氮、速效磷的質(zhì)量分數(shù)比）、翻耕頻率為1次/d、溫度37℃、含水率在22%～26%。進行28d的花盆修復，每隔7d測定1次土壤的微生物數(shù)量、土壤酶活性和石油含量。采用紫外分光光度法測定土壤石油含量［9］。

1.2.2 土壤微生物數(shù)量的測定

采用稀釋平板涂布培養(yǎng)計數(shù)法，細菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)，真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)，結(jié)果以每1g干土所含數(shù)量表示［10］。

1.2.3 土壤酶活性的測定

采用苯酚鈉比色法測定脲酶活性，采用鄰苯三酚（焦性沒食子素）比色法測定多酚氧化酶活性，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性，采用2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）還原法測定脫氫酶活性，采用茚三酮比色法［11］測定蛋白酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 修復過程中土壤微生物數(shù)量的變化

在優(yōu)化降解條件下，對石油污染土壤進行28d原位修復，每隔7d測定1次土壤中微生物總數(shù)（包括細菌、真菌和放線菌）。由于細菌、真菌和放線菌的生長速率、代謝途徑以及對石油烴的利用性不同，導致在修復過程中微生物數(shù)量增長發(fā)生了變化，實驗結(jié)果列于表1。

表1 石油污染土壤修復過程中微生物數(shù)量的變化Table 1 The variety of microorganism population quantity during remediation of oil contaminated soil

由表1可知，在修復初期，由于高效石油降解菌對土壤環(huán)境處于適應階段，微生物數(shù)量幾乎沒有改變。只有土著微生物修復的土壤，由于土著微生物數(shù)量有限，高濃度的石油污染物對微生物的生長與代謝產(chǎn)生抑制作用［12］，因此，微生物數(shù)量幾乎不變；隨著修復的進行，高效石油降解菌逐漸適應了環(huán)境，微生物數(shù)量激增；到了修復后期，由于易降解的石油組分被快速降解，一些難降解的高分子物質(zhì)會對微生物產(chǎn)生毒害作用［13］，同時由于酸性物質(zhì)的積累使得土壤微生物總數(shù)增長緩慢。

由表1還可知，當高效石油降解菌投加到石油污染土壤時，由于要適應環(huán)境條件且受石油濃度的選擇性作用，使得細菌數(shù)量變化不大，此時微生物總數(shù)幾乎不變；隨著時間的延長，適應了該環(huán)境的高效降解菌大量繁殖，利用石油污染物作為碳源，同時獲取適量的N、P等營養(yǎng)物質(zhì)，細菌數(shù)量激增；隨著修復的進行，由于易被微生物利用的石油組分減少、營養(yǎng)的失衡以及酸性物質(zhì)的積累［14］，引起部分細菌增長緩慢或者死亡。

土壤中真菌數(shù)量在修復7d沒有出現(xiàn)變化，表明該濃度石油類污染物質(zhì)的存在抑制了真菌的生長［15］；隨著修復的進行，真菌數(shù)量開始增長，此時的石油污染物在不斷地代謝和降解條件下適宜于真菌的生長，但細菌和放線菌的對數(shù)增長卻對真菌的生長產(chǎn)生抑制作用，因此真菌數(shù)量增長緩慢；到了修復末期，隨著可利用碳源的減少，石油中不易降解組分（如芳香類）不斷的積累，真菌對芳香烴有很強的降解作用［13］，此時細菌和放線菌處于競爭狀態(tài)，這兩者的作用刺激了真菌的對數(shù)增長。

土壤中放線菌數(shù)量在修復7d呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢；修復時間增至14d、21d，放線菌數(shù)量呈現(xiàn)對數(shù)增長，這是因為隨著石油污染物的代謝和降解，會選擇性地刺激放線菌的生長［16］；修復末期，由于微生物生長需要消耗大量的營養(yǎng)元素，導致土壤中營養(yǎng)供給不足，微生物數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢。

2.2 修復過程中土壤酶活性的變化

在優(yōu)化降解條件下，對石油污染土壤進行28d原位修復，每隔7d測定1次土壤酶活性，包括脲酶、蛋白酶、脫氫酶、過氧化氫酶以及多酚氧化酶，實驗結(jié)果示于圖1。

由圖1可知，修復初始階段，土壤脲酶活性逐漸增加，修復14d后，脲酶活性的增長速率逐漸下降，修復后期脲酶活性的增長速率又有所升高。石油的部分組成物質(zhì)在初始階段可以被土壤中與脲酶活性有關(guān)的微生物利用［17］，微生物總數(shù)增多，因此脲酶活性增強，與陳亮等［18］關(guān)于脲酶活性與微生物總數(shù)關(guān)系的結(jié)果一致；修復14d后，由于可利用碳源的減少，以及營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏導致微生物總數(shù)的減少，土壤脲酶活性有所下降，表明脲酶對環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)變化較為敏感［19］；隨著石油污染物的不斷降解，土壤中微生物總數(shù)和種類不斷增多，從而使得脲酶活性有所增強［20］。

圖1 修復過程中土壤酶活性隨時間的變化Fig.1 The variety of enzyme activity with time during remediation of oil contaminated soil

由圖1還可知，在修復初始階段，土壤蛋白酶的活性幾乎沒有變化，隨著修復的進行，蛋白酶活性略有變化，但變化幅度不大。土壤蛋白酶活性的增加可能是因為土壤中有效氮素為微生物提供營養(yǎng)，使得微生物總數(shù)增多，但變化不明顯。

在修復初始階段，土壤脫氫酶活性有所增加；隨著修復的進行，活性變化反而不明顯；到了修復后期，活性幾乎無變化。脫氫酶在生物修復的初始階段作用非常顯著，它可以活化有機物中的氫原子，使石油污染物發(fā)生氧化，同時也由于高效降解菌的添加使得微生物總數(shù)有所增加，從而導致土壤脫氫酶活性增加，與王靖等［21］關(guān)于微生物總數(shù)與土壤脫氫酶活性的結(jié)論具有一致性。隨著修復的進行，易降解的石油類物質(zhì)減少，微生物總數(shù)也隨之下降，因此脫氫酶活性增加緩慢。

隨著修復的進行，土壤過氧化氫酶活性有較大的增長趨勢，到了修復后期，酶活性的增長速率開始下降，但仍然呈現(xiàn)增強的趨勢。過氧化氫酶活性可以反映土壤除去呼吸過程中產(chǎn)生的過氧化氫的能力，若過氧化氫一直積累卻始終得不到分解，將會對土壤中的微生物產(chǎn)生毒害作用。在修復初始階段，一定濃度的石油污染物可以作為底物碳源，被與過氧化氫酶有關(guān)的土壤微生物利用，從而使酶活性有所增強，過氧化氫得到降解，此時，土壤中微生物總數(shù)有所增加，從而使得過氧化氫酶活性增強；隨著修復的進行，土壤中可利用的碳源減少，使得與這種酶相關(guān)的微生物的數(shù)量稍有減少，從而使過氧化氫酶活性的增長速率下降。

在修復初始階段，土壤多酚氧化酶活性有所增加；隨著修復的進行，酶活性增加的速率變大；到了修復后期，酶活性增長的速率有所下降，但始終呈現(xiàn)增強的趨勢。多酚氧化酶是石油氧化分解過程中具有重要功能的一類酶［22］，其活性與土壤中酚的含量成正相關(guān)。在石油污染土壤的生物修復過程中，會產(chǎn)生多種酚類物質(zhì)，從而刺激微生物產(chǎn)生多酚氧化酶，提高了土壤中多酚氧化酶的活性。在修復初期，一定濃度的石油作為底物被與多酚氧化酶相關(guān)的微生物所利用［17］，從而促進石油的降解，使得酶活性有所增強，酶活性的增強在一定程度上是微生物總數(shù)增多的表現(xiàn)；隨著修復的進行，多酚氧化酶活性增加的速率加快，是因為在修復過程中不斷產(chǎn)生酚類物質(zhì)，刺激微生物產(chǎn)生大量的多酚氧化酶，而且隨著石油污染物的降解，削弱了高濃度石油污染物對多酚氧化酶活性的抑制作用，從而使得酶活性有所增強；到了修復末期，由于土壤中多酚類有毒物質(zhì)的積累［23］影響到了微生物的數(shù)量，從而使酶活性增長的速率有所下降。

2.3 土壤修復過程中石油降解率的變化

在優(yōu)化降解條件下，對石油污染土壤進行28d原位修復，每隔7d測定1次石油降解率，實驗結(jié)果示于圖2。

由圖2可知，在修復初始階段，投加高效降解菌的土壤的石油降解率沒有明顯的提高；隨著修復的進行，石油降解速率加快；到了修復末期，石油降解速率有所下降，但仍然呈現(xiàn)增大的趨勢。在土壤修復初始階段，高效降解菌首先要適應環(huán)境，而且接種數(shù)量有限，使得石油降解率沒有明顯提高；此時微生物總數(shù)沒有快速增加，因為在這一階段高效降解菌比較容易利用石油污染物作為能源和碳源，在降解過程中發(fā)揮主導作用，從而抑制土著微生物的活性和生物可利用性［24］。隨著修復的進行，一定濃度范圍的石油污染物可以促進土壤微生物的生長增殖；此時微生物總數(shù)急劇增加，微生物的增長速率最快，最有利于石油污染物的降解。到了修復末期，由于可利用碳源減少，以及有毒有害物質(zhì)積累，使得微生物總數(shù)有所減少，石油降解速率逐漸下降。

圖2 土壤修復過程中石油降解率隨時間的變化Fig.2 The variety of oil degradation rate with time during remediation of oil contaminated soil

2.4 土壤修復過程中微生物數(shù)量、土壤酶活性和石油降解率的相關(guān)性分析

2.4.1 微生物數(shù)量與石油降解率的相關(guān)性

根據(jù)修復過程中微生物數(shù)量和石油降解率的變化（表1和圖2），采用SPSS18.0分析軟件建立微生物（細菌、真菌和放線菌）數(shù)量和石油降解率之間的相關(guān)性，結(jié)果列于表2。

表2 土壤修復過程中石油降解率和微生物數(shù)量的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between oil degradation rate and microbial populations during remediation of oil contaminated soil

由表2可知，微生物總數(shù)變化和石油降解率之間相關(guān)性非常顯著，相關(guān)性系數(shù)為0.977。由此可知，微生物總數(shù)越多，越有利于石油污染物的降解，與劉敬奇等［5］的研究結(jié)果一致。

細菌數(shù)量和石油降解率之間相關(guān)性非常顯著，相關(guān)性系數(shù)為0.989，細菌數(shù)量越多越有利于石油污染物的降解。Sathishkumar等［25］研究表明，細菌比真菌和放線菌更能有效地降解石油，且土壤中本身存在的細菌由于能夠利用范圍很寬的石油污染，因此隨著細菌數(shù)量的激增，石油降解率顯著增加。

真菌和放線菌數(shù)量與石油降解率之間相關(guān)性不顯著，可能是因為真菌和放線菌在土壤中的數(shù)量有限，也可能是因為真菌和放線菌降解石油污染物中的難降解組分，從而對石油降解率的貢獻不大。

2.4.2 土壤酶活性與石油降解率的相關(guān)性

采用SPSS18.0分析軟件建立土壤酶活性和石油降解率之間的相關(guān)性，結(jié)果列于表3。

表3 土壤修復過程中石油降解率和土壤酶活性的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between oil degradation rate and soil enzyme activity during remediation of oil contaminated soil

由表3可知，脲酶活性、脫氫酶活性和多酚氧化酶活性與石油降解率之間的相關(guān)性非常顯著，相關(guān)性系數(shù)大于0.96。土壤中一定濃度的石油可以作為碳源被土壤中與脲酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性有關(guān)的微生物所利用（見2.3節(jié)），且隨著土壤中可利用碳源的減少，使得與這些酶相關(guān)的微生物的數(shù)量相應減少，表現(xiàn)為酶活性的下降，最終導致石油降解率的下降。

由表3還可知，蛋白酶和脫氫酶活性與石油降解率之間的相關(guān)性顯著，相關(guān)性系數(shù)分別為0.944和0.934。蛋白酶和脫氫酶在石油污染土壤修復過程中酶活性變化不顯著（見2.3節(jié)）可能與這些酶相關(guān)的微生物數(shù)量變化不顯著有關(guān)。

3 結(jié) 論

（1）石油污染土壤中微生物總數(shù)、細菌數(shù)量、脲酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性與石油降解率的相關(guān)性非常顯著，且呈正相關(guān)關(guān)系；因此在修復時應致力于提高微生物總數(shù)、細菌總數(shù)以及增強脲酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶活性，以達到高石油降解率。

（2）蛋白酶和脫氫酶活性變化與石油降解率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，因此在修復石油污染土壤時可以提高蛋白酶和脫氫酶活性，以達到提高石油降解率的目的。

（3）真菌數(shù)量和放線菌數(shù)量變化與石油降解率的相關(guān)性不顯著。

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