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    棗花蜜對無水乙醇誘導小鼠胃黏膜損傷的影響

    2014-12-31 09:40:40施純禮朱瓊雪
    胃腸病學和肝病學雜志 2014年3期
    關鍵詞:花蜜無水乙醇灌胃

    施純禮,朱瓊雪,陳 靜

    1. 福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院干部科,福建 福州350004; 2. 福建醫(yī)科大學檢驗系; 3. 福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科

    胃潰瘍是胃黏膜的防御因子和攻擊因子失衡引起的一種常見病和多發(fā)病,自然人群中約10%的人一生中患過此?。?]。胃黏膜保護一直是傳統(tǒng)的胃潰瘍治療思路。盡管上世紀80 年代幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的發(fā)現(xiàn)和質子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs)的出現(xiàn)在很大程度上改善了胃潰瘍的治療策略,但也有越來越多的研究發(fā)現(xiàn),即使在抗H.pylori和PPIs 廣泛應用的情況下,胃黏膜保護在消化性潰瘍治療中仍有著重要的作用;同時,在非H.pylori 相關的胃黏膜損傷,特別是NSAIDs 相關潰瘍、酒精等理化因素相關胃黏膜損傷的治療中,胃黏膜保護策略的地位也十分重要。最近一些有關胃潰瘍的實驗性研究發(fā)現(xiàn),氧自由基(ROS)在其發(fā)病機制中起著重要作用。

    另一方面,現(xiàn)有潰瘍藥物治療的長療程和對藥物毒副作用的擔心在一定程度上影響了胃黏膜損害患者使用現(xiàn)有治療藥物的順應性,尋找一種天然的、易為患者接受的胃黏膜保護手段可能有助于改變患者對治療藥物的抵觸心理。

    近年來研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜中存在大量具有抗氧化作用的酚類化合物以及抗壞血酸、β-胡蘿卜素、過氧化氫酶、過氧化物酶等具有很強抗氧化活性的物質,有助于清除自由基,保護機體免受自由基攻擊。

    本實驗擬采用乙醇誘導小鼠急性胃黏膜損傷,觀察潰瘍指數(shù)及胃黏膜病理改變,檢測其對大鼠血漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量變化,探討棗花蜜對乙醇誘導小鼠胃黏膜損傷的影響,探究其可能的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 一般材料

    1.1.1 試劑與藥物:棗花蜜(福建神蜂科技開發(fā)有限責任公司);無水乙醇(開封化學試劑總廠)。SOD、MDA 測試盒(購自南京建成生物工程研究所,中國)。1.1.2 實驗動物:昆明種小鼠(體質量18 ~22 g)50只,雌雄不拘,購自吳氏動物中心。購入后適應1 周,普通顆粒食料喂養(yǎng)[12 h:12 h 晝夜周期,(22 ±1)℃],實驗動物嚴格按照《福建醫(yī)科大學動物實驗管理條例》(閩醫(yī)大[2003]文348 號)進行。大鼠以網(wǎng)格底籠養(yǎng)以防食糞行為,自由飲水。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 最佳乙醇造模濃度選擇:5 只昆明小鼠編號1 ~5 號,分別以濃度為20%、40%、60%、80%、100%的乙醇各0.1 ml 灌胃,觀察小鼠活動情況。1 d 后全部脫頸椎處死,取全胃沿大彎剖開,生理鹽水沖洗,用濾紙吸干水分,觀察各劑量乙醇所造成的小鼠胃黏膜損傷。

    1.2.2 動物分組及干預:50 只昆明小鼠隨機分為空白對照組(C 組)、蜂蜜預防組(P1組)、預防對照組(P2組)、蜂蜜治療組(T1組)和治療對照組(T2組),每組10 只,分籠飼養(yǎng)。P1組以0.1 ml/d 棗花蜜、P2組以等量生理鹽水(NS)灌胃9 d,第10 天予0.1 ml 無水乙醇灌胃;T1組、T2組予0.1 ml 無水乙醇灌胃后第2 天起分別予0.1 ml/d 棗花蜜或等量NS 灌胃9 d;C 組予等量NS 灌胃10 d。

    1.2.3 SOD 及MDA 檢測:各組小鼠于第11 天以摘除眼球法采血約0.5 ml,采用羥胺法檢測血漿SOD 活性,TAB 法測定MDA 含量。按照試劑盒說明書操作。

    1.2.4 標本處理及觀察:各組小鼠于第11 天眼球采血后脫頸椎處死,取全胃置10%中性甲醛溶液10 min后,取出展平,沿胃大彎剪開,NS 沖洗,濾紙吸干水分。

    1.3 胃標本處理

    1.3.1 Guth 潰瘍指數(shù)計算:以游標卡尺測量病灶長度。點狀出血糜爛病灶計1 分;條狀病灶長度<1 mm 者計2分;≥1 mm 且<2 mm 計3 分,≥2 mm 且<4 mm 計4 分,≥4 mm 計5 分,以全部病灶之和為潰瘍指數(shù)[2]。

    1.3.2 潰瘍抑制率計算:潰瘍抑制率(%)=(對照組潰瘍指數(shù)- 干預組潰瘍指數(shù))/對照組潰瘍指數(shù)×100%。

    1.3.3 組織學觀察:全胃置10%中性甲醛溶液室溫固定24 h,常規(guī)梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片厚4 μm,蘇木精-伊紅染色,光鏡觀察。

    1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0 統(tǒng)計分析軟件分析,各組數(shù)據(jù)以x ±s 表示,不符合正態(tài)分布或方差不齊時,進行Log10 為底的對數(shù)轉換,直到滿足以上2 項條件為止。P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 預實驗5 只昆明小鼠活動情況及胃黏膜潰瘍指數(shù) 5 只昆明小鼠分別編號后用不同濃度乙醇灌胃,灌胃24 h 后胃部切開,5 只小鼠胃黏膜所見以4 號及5 號小鼠胃黏膜損傷最為嚴重,均有片狀出血點,生理鹽水沖洗后,4 號小鼠腺胃部黏膜呈鮮紅色,明顯充血、水腫及點、線狀糜爛,5 號小鼠相比4 號,出血點更多,腺胃部黏膜顏色呈深紅色,充血、水腫及糜爛均較4 號嚴重,其潰瘍指數(shù)也最高(見表1)。

    表1 預實驗5 只昆明小鼠活動情況及胃黏膜潰瘍指數(shù)結果Tab 1 The activities and gastric ulcer indexes of 5 Kunming rats in the pilot experiment

    2.2 棗花蜜對無水乙醇致小鼠胃潰瘍的潰瘍抑制率及潰瘍指數(shù)的影響

    2.2.1 大體病理及潰瘍抑制率分析:正常小鼠禁食24 h 后,胃黏膜呈淡紅色,表面可見黏膜皺襞。P2組小鼠胃體部出現(xiàn)點狀、片狀褐色出血點,部分有嘔吐咖啡色物,NS 沖洗后可見腺胃部黏膜深紅色,明顯充血、水腫及點、線狀糜爛,P1組胃黏膜病灶數(shù)量及總面積較P2組明顯減少,潰瘍抑制率為85.41% (P <0.05),T1組較T2組有減少趨勢,潰瘍抑制率為0.09% (P >0.05,見表2)。

    2.2.2 潰瘍指數(shù)分析:蜂蜜預防組小鼠的潰瘍指數(shù)明顯降低,與預防對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。治療組小鼠胃黏膜損傷已基本愈合,蜂蜜治療組與治療對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。

    表2 棗花蜜對無水乙醇誘導胃潰瘍小鼠潰瘍指數(shù)、血漿SOD活性及MDA 含量的影響(x±s)Tab 2 The influence of jujube nectar on the gastric ulcer indexes,the plasma SOD activity and the MDA concentration in the plasma of absolute alcohol-induced gastric-ulcer groups (x±s)

    2.2 棗花蜜對無水乙醇致小鼠胃潰瘍的組織學影響

    光鏡下空白對照組小鼠胃壁四層結構清晰,腺體排列較整齊,胃黏膜表面光滑,上皮完整,腺體排列整齊。P2組小鼠胃壁可見上皮不完整,多處表面糜爛缺損、出血和炎性滲出。P1組可見程度不等的炎細胞浸潤、充血、表面糜爛,病灶數(shù)量和程度較預防對照組均有所減輕。T1組和T2組光鏡下小鼠胃壁結構完整,少有炎性滲出或黏膜缺損糜爛,部分小鼠胃可見到新鮮肉芽組織。

    2.3 棗花蜜對無水乙醇誘導胃潰瘍模型小鼠血漿SOD 活性及MDA 含量的影響 與C 組比較,SOD 活性和MDA 含量在P1組無明顯變化,P2組SOD 活性顯著降低,而MDA 含量顯著升高(P 均<0.05);相比于P2組,P1組SOD 活性顯著升高,而MDA 含量顯著降低(P <0.05);與C 組比較,T1組SOD 活性無明顯變化,而T2組仍降低(P <0.05),T1組及T2組MDA 含量與C 組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P >0.05,見表2)。

    3 討論

    胃黏膜屏障的正常保護功能是維持胃腔和胃黏膜內氫離子高梯度狀態(tài)的重要保證。乙醇具有親酯性和溶脂能力,高濃度乙醇因而可以直接破壞胃黏膜屏障,胃腔內氫離子便會彌散進入胃黏膜內,從而進一步加重胃黏膜的損害,最終導致胃黏膜的糜爛和出血。臨床上因大量飲酒或引用烈性白酒導致胃潰瘍發(fā)作、胃出血的病例并不少見。

    本實驗中,P1組小鼠潰瘍指數(shù)明顯低于P2組,推測蜂蜜對預防酒精引起的小鼠胃黏膜損傷有保護作用,提示蜂蜜可能有增強胃黏膜的抗損傷功能,日常食用蜂蜜對預防飲酒引起急性胃黏膜損傷可能有一定作用。

    胃潰瘍的發(fā)生機制與攻擊性因子和防御因子失衡有關。攻擊因子除酸腐蝕外,代謝過程的ROS 損傷亦起了重要的作用。ROS 已證實是破壞胃黏膜防御功能、導致潰瘍形成的一個重要因素,其在細胞內主要通過兩種途徑代謝:一是在SOD 催化下生成H2O2,再進一步被谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)或過氧化氫酶(catalase,CAT)氧化成H2O 和CO2,因此,SOD 含量降低與胃黏膜損害加重有關,SOD 活性可直接反映機體清除ROS 的能力,也體現(xiàn)了機體抗氧化保護系統(tǒng)的功能;ROS 的另一種代謝途徑是攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,產(chǎn)生脂質過氧化的產(chǎn)物MDA,故MDA 含量可間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。

    無水乙醇可誘導胃黏膜ROS 產(chǎn)生,其可能機制包括:影響SOD 等還原酶的表達,促進ROS 產(chǎn)生;引起胃黏膜血管內皮損傷,致微循環(huán)障礙、組織缺血、ROS增多;炎癥相關的中性粒細胞浸潤,通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生ROS;同時,乙醇代謝本身亦產(chǎn)生ROS[3]。

    我們發(fā)現(xiàn)棗花蜜對乙醇引起的胃黏膜損傷有預防作用,且此作用通過影響SOD 活性實現(xiàn)。實驗顯示P1組的SOD 活性相對于P2組顯著上升,說明棗花蜜可以增加SOD 的產(chǎn)生,蜂蜜含有多種維生素和礦物質,如其中所含維生素VitB2、VitB6 是多種氧化酶的輔基,而所含酮、錳等礦物質可與SOD 結合而使其成為SOD 在人體內的存在形式,因此蜂蜜可為SOD 的合成提供原料,提高SOD 活力。蜂蜜也可降低小白鼠體內MDA 含量,可能原因為蜂蜜提高了SOD 等氧化酶的活力,使得ROS 通過SOD 途徑清除,從而降低MDA含量。有多項有關蜂蜜抗氧化作用的研究[4-7]與我們得到相同的結論。

    蜂蜜外用有促進傷口愈合的作用[8-9],因此我們推測蜂蜜可能促進胃黏膜損傷的愈合。但本實驗中,蜂蜜治療組和治療對照組經(jīng)過9 d 蜂蜜灌胃后,小鼠胃黏膜基本愈合,未能發(fā)現(xiàn)蜂蜜有明顯的促進愈合優(yōu)勢。然而,雖然大體觀T1組與T2組潰瘍均已愈合,T1組SOD 活性、MDA 含量已恢復至正常水平,但T2組的SOD 活性仍顯著低于C 組,提示棗花蜜可能促進SOD活性的恢復,有利于清除無水乙醇導致的ROS 增加。另一方面,T2組SOD 水平雖未恢復正常,但T1組和T2組的MDA 水平與C 組比較均無顯著差異,提示可能存在其他抗氧化物質的作用,具體機制有待進一步研究。

    綜上所述,我們發(fā)現(xiàn),棗花蜜對無水乙醇誘導的小鼠胃潰瘍有預防作用,可能是與影響SOD 活性、促進ROS 清除、發(fā)揮抗氧化作用的機制相關,但蜂蜜對無水乙醇致小鼠胃潰瘍的預防作用與蜂蜜的濃度、劑量關系仍有待進一步探討。

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