直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸高產(chǎn)菌株的選育

徐國強(qiáng) ， 竇文芳 ， 許泓瑜 ， 張曉梅 *

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫，214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122）

L-絲氨酸（L-serine）是一種非必需氨基酸，具有重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品及化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。L-絲氨酸的市場需求量很大[1]。目前，L-絲氨酸的主要生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)水解法和前體轉(zhuǎn)化法，而這些方法存在成本較高、產(chǎn)率較低及環(huán)境污染較大等問題，限制了L-絲氨酸的規(guī)模化生產(chǎn)。相比之下，以可再生資源糖為原料的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸則受到廣泛關(guān)注。

目前，發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的微生物主要有黃色短桿菌[2]、重組大腸桿菌[3]和谷氨酸棒桿菌[4-5]。其中谷氨酸棒桿菌（Corrynebacterium glutamicum）已廣泛地用于各種氨基酸的生產(chǎn)，由于谷氨酸棒桿菌的生理學(xué)、生物化學(xué)及遺傳學(xué)信息已較為豐富[6]，對其進(jìn)行進(jìn)一步的代謝工程改造也較為方便，因此，采用谷氨酸棒桿菌來生產(chǎn)L-絲氨酸具有諸多的優(yōu)勢。

谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸的合成途徑見圖1。主要有3個關(guān)鍵酶：包括3-磷酸甘油酸脫氫酶（PGDH，serA）、 磷 酸 絲 氨 酸 氨 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （PAST，serC）、磷酸絲氨酸磷酸酶（PSP，serB）。 降解途徑包括2個關(guān)鍵酶，分別是L-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT，glyA）和 L-絲氨酸脫氫酶（L-serDH，sdaA）。Peters-Wendisch P等[7]證實(shí)了高濃度的L-絲氨酸對C.glutamicum中的PGDH存在反饋抑制作用。他們對L-絲氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行了改造，使得模式菌株C.glutamicum ATCC13032可以積累L-絲氨酸到[4，8-9]。而關(guān)于野生型谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-絲氨酸卻鮮有報道。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期從土壤中篩選獲得一株可以利用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的野生型C.glutamicum SYPS-062，并對該菌株展開了一系列的研究[5，10-14]。但還是存在L-絲氨酸產(chǎn)量較低發(fā)酵周期較長等問題，擬采用L-絲氨酸結(jié)構(gòu)類似物D-絲氨酸抗性平板篩選突變株從而解除L-絲氨酸對PGDH的反饋抑制，促進(jìn)L-絲氨酸的進(jìn)一步積累。

利用誘變育種技術(shù)獲得具有優(yōu)良性狀的突變株，然后通過全基因組測序找出引起優(yōu)良性狀的遺傳差異，進(jìn)而運(yùn)用代謝工程的手段對菌株進(jìn)行定向改造[15]，這種利用反向代謝工程改造菌株的策略將具有明顯的優(yōu)勢。作者旨在通過傳統(tǒng)誘變育種的方法，獲得L-絲氨酸產(chǎn)量等發(fā)酵特性明顯變化的C.glutamicum突變株，為下一步進(jìn)行反向代謝工程研究提供有價值的實(shí)驗(yàn)材料。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of L-serine in C.glutamicum

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 C.glutamicum SYPS-062：可直接利用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸，由江南大學(xué)制藥工程研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

1） 斜面培養(yǎng)基：Peptone 10 g/L，Beef extract 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 3 g/L，Agar 20 g/L；pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

2）種子培養(yǎng)基：Glucose 30 g/L，corn steep liquor 20 g/L， （NH4）2SO420 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CO（NH2）21.5 g/L，cottonseed flour 20 g/L；pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：Sucrose 60 g/L，（NH4）2SO430 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.02 g/L，biotin 50 μg/L，streptomycin 10 μg/L，CaCO330 g/L， 維生素 B1450 μg/L；pH 7.0，121 ℃滅菌 10 min。

4）抗性篩選培養(yǎng)基：Peptone 10 g/L，Beef extract 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 3 g/L，Agar 20 g/L，在此基礎(chǔ)上加入D-serine，使其在培養(yǎng)基中的終質(zhì)量濃度為150 g/L。

1.1.3 試劑 DES：為上海試劑廠產(chǎn)品；D-serine：為美國Sigma公司產(chǎn)品；其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1）斜面活化及種子培養(yǎng)：將保存在4℃冰箱中的斜面菌種接種到新鮮斜面，30℃靜置培養(yǎng)24 h；然后將活化后的菌種接入種子培養(yǎng)基（裝液量為30 mL/250 mL 三角瓶），115 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng) 18 h。

2）搖瓶發(fā)酵：按5%的接種體積分?jǐn)?shù)將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基 （裝液量為20 mL/250 mL三角瓶），115 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng) 96 h。

1.2.2 誘變方法及D-serine抗性變異株的檢測方法 先將種子培養(yǎng)到對數(shù)生長期中后期，再以50%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到新鮮的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h，使所有細(xì)胞達(dá)到同步生長。將培養(yǎng)液無菌離心，收集菌體，用無菌的0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液將菌體制成108個/mL的菌懸液，離心洗滌3次，轉(zhuǎn)入無菌的帶玻璃珠的三角瓶中打散，得單細(xì)胞懸液。取1 mL的菌懸液，加入硫酸二乙酯，使其終體積分?jǐn)?shù)為2%，30℃振蕩反應(yīng)20 min，誘變結(jié)束后快速離心終止反應(yīng)，用無菌的0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌3次，將誘變后的單細(xì)胞懸液接種到新鮮的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，然后直接涂布抗性篩選平板，30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，長出的大菌落即為D-serine r，挑選這些菌落進(jìn)行初篩。

1.2.3 分析方法 細(xì)胞干重的測定 （dry cell weight，DCW）：取發(fā)酵液 5 mL，加 12 mL 0.25 mol/L的稀鹽酸，待反應(yīng)完畢后，經(jīng)8 000 r/min離心5 min后傾去上清液，用去離子水洗滌兩次，置于105℃烘箱干燥至恒質(zhì)量后稱量；蔗糖測定方法：采用間苯二酚法；L-絲氨酸定量測定方法：采用日立835-50氨基酸自動分析儀。色譜條件如下：柱溫為40℃；流速為 1.0 mL/min；紫外檢測器：338、262 nm （Pro，Hypro；熒光檢測器：激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm；激發(fā)波長 266nm，發(fā)射波長 305nm （Pro，Hypro）。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株及誘變培養(yǎng)時間的確定

將C.glutamicum SYPS-062的斜面保藏菌種劃線分離，挑選菌落形態(tài)較大的32個單菌落轉(zhuǎn)接到斜面上，培養(yǎng)24 h后接種至搖瓶進(jìn)行產(chǎn)酸能力的初篩，再將產(chǎn)酸較高的5株菌進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)36號菌產(chǎn)酸最高，然后將該突變株連續(xù)傳代5次考察其遺傳穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酸未見明顯變化。表明其遺傳穩(wěn)定性較好，因此，確定菌株C.glutamicum SYPS-062-36為誘變的出發(fā)菌株，用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

出發(fā)菌株的生長曲線見圖2。從種子生長曲線上可以看出，該菌經(jīng)過16～18 h的培養(yǎng)后，到達(dá)對數(shù)生長中后期，此時細(xì)胞代謝活力最為旺盛，并且處在這個時期的細(xì)胞對誘變劑更為敏感。因此，確定誘變所用細(xì)胞的培養(yǎng)時間為16～18 h。

圖2 出發(fā)菌的種子生長曲線Fig.2 Growth curve in the seed medium of parent strain

2.2 誘變育種

以硫酸二乙酯（DES）為誘變劑，誘變時間為20 min，測定了誘變劑濃度與致死率的關(guān)系，結(jié)果見表1。從表1可以看出，選擇誘變劑體積分?jǐn)?shù)為2%比較合適，此時致死率為71.8%。

表1 對菌株C.glutamicum SYPS-062-36 DES誘變致死率Table 1 Determination of the lethality on C.glutamicum SYPS-062-36 treated by DES

對出發(fā)菌株SYPS-062-36（圖3a）進(jìn)行誘變，在150 g/L D-絲氨酸抗性平板上隨機(jī)挑選突變株，獲得一株產(chǎn)酸較高P3，其產(chǎn)酸為（7.35±0.21）g/L，然后對突變株P(guān)3在同樣的條件下進(jìn)行第二輪誘變，經(jīng)搖瓶復(fù)篩，獲得一株高產(chǎn)L-絲氨酸菌株SYPS-062-33a，將該突變株劃線分離，得到一株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株SYPS-062-33a-18，其顯微圖像見圖3b。

圖3 谷氨酸棒桿菌SYPS-062-36及其突變株SYPS-062-33a-18的顯微鏡圖Fig.3 Microscope images of C.glutamicum SYPS-062-36 and its derivative SYPS-062-33a-18

2.3 高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性

高產(chǎn)菌與出發(fā)菌在發(fā)酵過程中生物量、L-絲氨酸產(chǎn)量、殘?zhí)呛康淖兓妶D4。由圖4可以看出，菌體進(jìn)入對數(shù)生長后期時，高產(chǎn)菌的生物量明顯高于出發(fā)菌，發(fā)酵結(jié)束時，生物量為（6.56±0.23）g/L，而出發(fā)菌株為（5.61±0.24）g/L，較出發(fā)菌株提高了17.9%。高產(chǎn)菌在90 h時L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到最高，為（11.0±0.25）g/L，L-絲氨酸產(chǎn)量較出發(fā)菌（6.65±0.23）g/L提高了65.4%，且發(fā)酵周期提前約6 h；高產(chǎn)菌株在對數(shù)生長前期（24～60 h）糖耗速率不及出發(fā)菌株，但在對數(shù)生長中后期（60～78 h）的糖耗速率高于出發(fā)菌株。

文獻(xiàn)[16-17]報道，在谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)，大約7.5%的碳流是用于細(xì)胞生長和代謝所需（如蛋白質(zhì)的合成、甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸、磷脂的合成及一碳單元的產(chǎn)生）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：出發(fā)菌株C.glutamicum SYPS-062積累L-絲氨酸的原因可能與SHMT活性較低有關(guān)[10]。在本研究中，高產(chǎn)菌株C.glutamicum SYPS-062-33a-18的L-絲氨酸對蔗糖的轉(zhuǎn)化率為0.183±0.009 mol/mol，較出發(fā)菌株C.glutamicum SYPS-062提高了64.9%，說明誘變使得更多的碳流流向L-絲氨酸。

圖4 出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062-36和其突變株SYPS-062-33a-18的發(fā)酵過程曲線Fig.4 Time course of L-serine fermentation by the parental strain C.glutamicum SYPS-062-36 and the mutant C.glutamicum SYPS-062-33a-18 in shake-flask fermentation

此外，將出發(fā)菌及高產(chǎn)菌分別發(fā)酵96 h和90 h，發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后，在相同條件下測定氨基酸組分及含量。結(jié)果表明：出發(fā)菌的丙氨酸（Ala）產(chǎn)量為（2.05±0.15） g/L，纈氨酸 （Val）的產(chǎn)量為（1.51±0.19）g/L；相比之下，高產(chǎn)菌株的丙氨酸產(chǎn)量為（6.56±0.24） g/L，纈氨酸的產(chǎn)量為（3.00±0.20）g/L，分別較出發(fā)菌株提高了220%和99%。甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）等的產(chǎn)量也有了較大幅度的提高。

3 結(jié)語

以谷氨酸棒桿菌C.glutamicum SYPS-062-36為出發(fā)菌株，經(jīng)DES逐級誘變處理，獲得對D-絲氨酸有一定抗性的突變株C.glutamicum SYPS-062-33a-18，其 L-絲氨酸產(chǎn)量為（11.0±0.25） g/L，較出發(fā)菌株產(chǎn)酸量提高了65.4%。此外，突變株C.glutamicum SYPS-062-33a-18可以積累更多的丙氨酸、纈氨酸等其它氨基酸。本研究不僅以D-絲氨酸作為抗性平板篩選得到高產(chǎn)L-絲氨酸的突變株，而且為下一步進(jìn)行反向代謝工程的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

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