利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的工業(yè)化試驗(yàn)

朱曉宏， 朱曉慧， 魏 薇

（江蘇省微生物研究所有限公司，江蘇 無(wú)錫 214063）

環(huán)磷腺苷具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)很多酶催化反應(yīng)的功能，體內(nèi)很多激素的作用也是通過(guò)環(huán)磷腺苷區(qū)進(jìn)行的，起著激素媒介物質(zhì)的作用[1]。

現(xiàn)已證明環(huán)磷腺苷（cAMP）是睪丸甾酮、雌激素、腎上腺激素、甲狀腺激素及胎盤激素等許多激素的第二信使。當(dāng)各種激素與細(xì)胞表面作用點(diǎn)接觸時(shí)，發(fā)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)化成環(huán)磷腺苷（cAMP）。細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷的濃度變化又引起了細(xì)胞各種代謝的變化。而且環(huán)磷腺苷與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂肪分解、類固醇合成均有關(guān)系。環(huán)磷腺苷與惡性腫瘤、內(nèi)分泌之間的關(guān)系十分密切。在特定條件下，環(huán)磷腺苷對(duì)癌細(xì)胞具有控制作用，對(duì)冠心病、牛皮癬等有緩解作用。

目前在我國(guó)，環(huán)磷腺苷主要作為醫(yī)藥品被應(yīng)用。環(huán)磷腺苷在醫(yī)藥上主要作為急性心肌梗塞搶救藥并用于冠心病、糖尿病、氣喘、牛皮癬等疾病的治療。

目前國(guó)內(nèi)環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)方法全是化學(xué)合成方法[2]。包括：

1）堿性水解法：David lipkin等人在1959年曾用堿性水解的工藝方法制得了環(huán)磷腺苷。此法主要是利用三磷酸腺苷（ATP）100℃時(shí)在氫氧化鋇強(qiáng)堿水溶液中水解并關(guān)環(huán)制得環(huán)磷腺苷。

2）活性酯類法：河北大學(xué)韓文炎和屠宛蓉在1986年報(bào)道了環(huán)磷腺苷的改進(jìn)合成工藝方法。5-腺苷酸、4-嗎啡啉-N，N-二環(huán)己基脒和金屬鈉在乙二醇單甲醚溶劑中反應(yīng)，合成了環(huán)磷腺苷。

3）DCC 脫水法[3]：M．Smith等在 1961年用 5 一腺苷酸和4一嗎啡啉一N，N一二環(huán)己基脒在吡啶溶劑中，用DCC作脫水劑進(jìn)行脫水反應(yīng)，使5-腺苷酸發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng)，產(chǎn)物的收率可達(dá)80%。

4）三氯氧磷法：1989年，Genieser等報(bào)道了腺苷與三氯氧磷反應(yīng)得到腺苷的合成工藝路線。中間體腺苷二氯磷酸酯不經(jīng)過(guò)分離，加堿環(huán)化得到環(huán)磷腺苷。此法原料容易得到，反應(yīng)條件溫和適中，但收率偏低（49%）。

但以上方法全都屬于化學(xué)合成方法，反應(yīng)所需原料都具有毒性和污染，且工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)于昂貴。

1 材料與方法

1.1 菌種

作者所在研究室篩選育種得到的Bacillus.subtilis jsim-1277。該菌株與目前國(guó)內(nèi)鳥苷發(fā)酵菌種Bacillus.subtilis jsim-G518[4]相似，同樣源自肌苷產(chǎn)生菌Bacillus.subtilis jsim-1019。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨1.0 g/dL，玉米漿 0.3 g/dL，NaCl 0.3 g/dL，pH 7.0。 （固體培養(yǎng)基加瓊脂2 g/dL）

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖6.0 g/dL，尿素1.0 g/dL，酵母粉1.0 g/dL，豆餅水解液0.3 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，NaF 0.05 g/dL，MgSO40.1g/dL，pH 7.0。

1.3 搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1 搖瓶種子培養(yǎng) 接一環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面培養(yǎng)物，至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)式搖床，頻率 210 r／min，溫度 36℃，培養(yǎng)18 h。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將生長(zhǎng)良好的種子液接至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，接種體積分?jǐn)?shù)10%，旋轉(zhuǎn)式搖床，頻率210 r／min，溫度36℃，培養(yǎng)72 h后測(cè)定環(huán)磷腺苷質(zhì)量濃度。

1.4 自控發(fā)酵罐試驗(yàn)

自控發(fā)酵罐，容量30 L，溫度、轉(zhuǎn)速、溶氧、補(bǔ)料、滅菌均自控。種子用搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間18 h，接種體積分?jǐn)?shù)10%。發(fā)酵液裝量21 L，121℃滅菌15 min，溫控 36 ℃，通氣攪拌[5]。

1.5 20 M3環(huán)磷腺苷發(fā)酵試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)型不銹鋼發(fā)酵罐，二組六彎型攪拌，轉(zhuǎn)速可調(diào)，容量 20 M3，裝液 14 M3，pH、溶氧在線顯示，液氨調(diào)節(jié)pH裝置。標(biāo)準(zhǔn)型不銹鋼種子罐，六彎型攪拌轉(zhuǎn)速可調(diào)，容量 2 M3，裝液 1.4 M3，pH、溶氧在線顯示。

1.6 分析方法

高效液相色譜法。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含0.01 mol/L四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.3）-乙腈（85∶15）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為 258 nm。標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mg/mL，取20 μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟化鈉（NaF）質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的腺苷酸環(huán)化酶促進(jìn)劑NaF，環(huán)磷腺苷的發(fā)酵水平見表1。

表1 NaF質(zhì)量濃度對(duì)環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 1 Effect of various concentration of NaF on cAMP accumulation

NaF作為一種腺苷酸環(huán)化酶促進(jìn)劑，適當(dāng)添加可促使產(chǎn)品積累，0.05 g/dL是合適的。

2.2 磷酸氫二鉀（K2HPO4）質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的K2HPO4，環(huán)磷腺苷的發(fā)酵水平見表2。

表2 K2HPO4對(duì)環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 2 Effect of various concentration of K2HPO4on cAMP accumulation

Bacillus.subtilis jsim-1277積累環(huán)磷腺苷不同于其原始菌株Bacillus.subtilis jsim-X-13-4。后者積累腺苷，不需要額外提供磷酸[6]；而前者需要提供磷酸鹽以生成環(huán)磷酸基團(tuán)。從實(shí)驗(yàn)可知，K2HPO4在1 g/dL以下時(shí)，質(zhì)量濃度升高，產(chǎn)酸能力也升高；而質(zhì)量濃度更高時(shí)，產(chǎn)酸能力不再提高，分析1 g/dL K2HPO4已能提供生產(chǎn)足夠的磷酸基團(tuán)。過(guò)高的磷酸鹽質(zhì)量濃度會(huì)增加提取的壓力，故選擇1 g/dL K2HPO4最為合適。

2.3 pH對(duì)發(fā)酵的影響

自動(dòng)罐發(fā)酵過(guò)程中pH自然下降后，用液氨或氨水控制不同pH，環(huán)磷腺苷產(chǎn)量見表3。

表3 不同pH對(duì)環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 3 Effect of various pH on cAMP accumulation

通過(guò)試驗(yàn)知道，pH 6.7適合環(huán)磷腺苷的積累。

2.4 20 M3環(huán)磷腺苷發(fā)酵

種子罐2 M3，裝液1.4 M3，配料按材料與方法所述。種子液滅菌后調(diào)pH 7．0，接人3只茄子瓶斜面，溫度 36℃ ，風(fēng)量 1∶0．3，培養(yǎng)過(guò)程中不控制 pH。培養(yǎng)至18 h左右，pH降至6．0左右，鏡檢無(wú)雜菌，且大部分已斷裂，即移種至發(fā)酵罐。

發(fā)酵罐20 M3，裝液14 M3，配料按材料與方法所述。滅菌后用液氨調(diào)pH 7.0。培養(yǎng)溫度36℃，種子接入發(fā)酵后，起始風(fēng)量設(shè)置為1∶0.25，在12 h內(nèi)逐步增至最大，為1∶0.8。發(fā)酵過(guò)程中不斷取樣檢測(cè)產(chǎn)物積累量。發(fā)酵到后期，pH有上升趨勢(shì)，溶氧急速增加，環(huán)磷腺苷不再增長(zhǎng)，則放罐。

表4 20 M3發(fā)酵罐中環(huán)磷腺苷發(fā)酵狀況Table 4 ccAMP fermentation in 20 M3fermentor

20 M3發(fā)酵罐5批次平均生產(chǎn)環(huán)磷腺苷6.2 g/L，平均發(fā)酵周期62 h。菌種生產(chǎn)能力穩(wěn)定。

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)改造的枯草芽孢桿菌Bacillus.subtilis jsim-1277具有良好環(huán)磷腺苷生產(chǎn)能力，在最佳pH 6.7條件下，以葡萄糖為碳源、尿素、酵母粉、豆餅水解液為復(fù)合氮源，添以1 g/dL的K2HPO4和0.05 g/dL的NaF，能生產(chǎn)環(huán)磷腺苷6～7 g/L，發(fā)酵周期60 h略多，有較好的工業(yè)化價(jià)值。

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