細(xì)菌污染對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響

周文靜，馮穎，王慧紅，沈蓉蓉，徐維海

（浙江省杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心，杭州 310000）

體外胚胎培養(yǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)均有可能發(fā)生細(xì)菌污染，現(xiàn)在用于體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的培養(yǎng)液基本都含有抗生素，可以抑制多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，但耐藥菌株的存在卻仍然能夠污染胚胎培養(yǎng)體系，從而影響到胚胎發(fā)育。細(xì)菌污染對(duì)胚胎發(fā)育的影響目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文觀察了小鼠卵裂期胚胎受到污染后的發(fā)育情況，并對(duì)部分受污染胚胎更換含不同抗生素的培養(yǎng)液，觀察補(bǔ)救措施對(duì)污染胚胎發(fā)育結(jié)局的影響，探討胚胎細(xì)菌污染的處理思路。

一、材料與方法

1.大腸桿菌菌液制備：大腸桿菌由本院細(xì)菌室分離，為慶大霉素耐藥［最低抑菌濃度（MIC 12）μg／ml］，阿米卡星敏感（MIC≤2μg／ml）菌株，采用比濁和倍比稀釋配制100cfu／ml的菌懸液備用。

2.小鼠胚胎獲取和分組：5 只7 周齡的雌性C57BL／6J小鼠腹腔注射孕馬血清（PMSG）10U／只，48h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）10U／只，按雌雄比例1∶1合籠，24h后處死雌鼠取胚，剔除碎片較多和質(zhì)量差的胚胎。獲取90枚2-細(xì)胞胚胎，隨機(jī)分成3組，每組30個(gè)胚胎：A 組為對(duì)照組，B組為細(xì)菌污染后未采取干預(yù)組，C 組為細(xì)菌污染1d后更換含不同抗生素的培養(yǎng)液組。

3.培養(yǎng)條件：含10%血清代用品SSS（Irvine，美國(guó)）的G-1培養(yǎng)液（Vitrolife，瑞典）制成50μl的微滴（G-1培養(yǎng)液成分中已含有慶大霉素），礦物油覆蓋，所有胚胎置于微滴中37℃、6%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.實(shí)驗(yàn)方法：按組別在每個(gè)微滴加入10 個(gè)小鼠胚胎，每組3個(gè)微滴。在B組和C 組微滴中加入大腸桿菌懸液20μl，培養(yǎng)24h后（D1）觀察各組胚胎發(fā)育和細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并將C 組胚胎清洗后轉(zhuǎn)入新配制的添加了阿米卡星的G-1培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，72h后（D3）再次觀察各組胚胎發(fā)育和細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

5.觀察指標(biāo)：各組的胚胎發(fā)育、胚胎死亡、囊胚形成和細(xì)菌生長(zhǎng)情況。鏡下觀察，將卵裂球退化、崩解的胚胎判定為死亡。囊胚的分期和質(zhì)量評(píng)價(jià)根據(jù)David Gardner囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］。對(duì)微滴中培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，判定細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.D1觀察結(jié)果：A 組培養(yǎng)液清亮，胚胎全部存活；B組和C組培養(yǎng)液渾濁，鏡下觀察有密集的類似桿菌形態(tài)物質(zhì)存在；B 組和C 組的胚胎存活率均顯著低于A 組（P 均＜0.001），B 組和C 組之間的胚胎存活率無顯著性差異（P＞0.05）。B、C 兩組的存活胚胎卵裂球數(shù)和細(xì)胞間致密程度明顯低于A 組胚胎，呈現(xiàn)發(fā)育遲滯的現(xiàn)象（表1）。

2.D3觀察結(jié)果：A 組培養(yǎng)液清亮，胚胎全部形成囊胚；B 組培養(yǎng)液渾濁，胚胎全部死亡；C 組培養(yǎng)液清亮，囊胚形成率顯著高于B 組（P＜0.001），但明顯低于A 組（P＜0.001）（表1）；A 組囊胚以IV期和V 期囊胚為主，囊胚腔均已較好的擴(kuò)張，囊胚的內(nèi)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量較多，優(yōu)質(zhì)囊胚較多（96.7%）（表2），C 組囊胚腔較小，部分為囊胚腔未完全擴(kuò)張的II期囊胚，內(nèi)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)均較少，無優(yōu)質(zhì)囊胚（圖1）。細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果提示A 組和C組培養(yǎng)液中均無細(xì)菌生長(zhǎng)，B 組培養(yǎng)液中證實(shí)為大腸桿菌生長(zhǎng)。

表1 三組胚胎發(fā)育情況［n（%）］

表2 A、C兩組囊胚質(zhì)量評(píng)價(jià)

圖1 體外培養(yǎng)D3胚胎形態(tài)（×200）

三、討論

細(xì)菌污染是體外胚胎培養(yǎng)中可能發(fā)生的嚴(yán)重事件，精液、卵泡液、培養(yǎng)液和環(huán)境中的細(xì)菌都有可能成為污染來源，實(shí)驗(yàn)室可以通過加強(qiáng)無菌操作的意識(shí)、使用含有抗生素的培養(yǎng)液等方法進(jìn)行預(yù)防，但在IVF過程中胚胎污染仍然有一定的發(fā)生率，朱桂金等［1］曾報(bào)道胚胎污染的發(fā)生率為0.51%，最主要的污染來源是帶菌的精液，其中大腸桿菌是引起胚胎污染的最常見的病原體之一［2-3］。

細(xì)菌污染可以對(duì)胚胎的生長(zhǎng)和發(fā)育造成嚴(yán)重影響。細(xì)菌快速生長(zhǎng)繁殖，消耗了培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)，釋放大量對(duì)胚胎具有毒性的代謝物。大腸桿菌等革蘭氏陰性桿菌在繁殖或死亡時(shí)還釋放內(nèi)毒素，對(duì)胚胎具有細(xì)胞毒作用［3-4］。本研究采用大腸桿菌污染小鼠2-細(xì)胞胚胎，結(jié)果顯示，胚胎受到細(xì)菌污染第1天即出現(xiàn)死亡，存活胚胎的發(fā)育也受到了嚴(yán)重的影響，出現(xiàn)了較多的低質(zhì)量胚胎，不作處理繼續(xù)培養(yǎng)，胚胎則全部死亡。而對(duì)被污染胚胎進(jìn)行換液處理，能顯著改善污染胚胎發(fā)育的結(jié)局，因?yàn)楦鼡Q培養(yǎng)液能去除大部分的細(xì)菌，而新加入的抗生素能有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，因此存活胚胎得以繼續(xù)發(fā)育。部分受到污染的胚胎換液雖然能夠繼續(xù)發(fā)育形成囊胚，但發(fā)育潛能仍然受到了損傷，這些囊胚的囊胚腔均較小，部分囊胚腔未完全擴(kuò)張，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小，滋養(yǎng)細(xì)胞也較少，總體囊胚質(zhì)量較差。這說明雖然細(xì)菌污染已經(jīng)清除，但早期發(fā)生的細(xì)菌污染已經(jīng)對(duì)胚胎造成了損傷，有數(shù)據(jù)表明，由卵裂期質(zhì)量較差胚胎發(fā)育而來的囊胚，非整倍體概率增加，種植率和妊娠率均降低［5］。

人類胚胎培養(yǎng)中污染的胚胎處理仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的問題，我們通過對(duì)細(xì)菌污染的小鼠胚胎發(fā)育觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)于早期（D1）發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌污染，如果及時(shí)進(jìn)行換液和更換抗生素體系的處理，可以完全去除耐藥菌的污染，使部分有發(fā)育潛能的胚胎繼續(xù)發(fā)育。但是在本研究中，污染換液組得到的囊胚質(zhì)量并不高，這可能是由于污染菌以及其產(chǎn)生的各種毒素和代謝的酶類對(duì)胚胎細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和分子水平造成了遠(yuǎn)期的影響，沖洗和換液過程中也有可能對(duì)胚胎造成損傷，細(xì)菌污染對(duì)胚胎發(fā)育的遠(yuǎn)期影響仍需要進(jìn)一步的觀察和數(shù)據(jù)評(píng)估。對(duì)于卵巢功能較差的患者，能夠得到可供移植的胚胎的數(shù)量是有限的，如果可以對(duì)污染的胚胎進(jìn)行處理，對(duì)于去除污染并發(fā)育為囊胚的胚胎進(jìn)行移植，可增加病人妊娠的機(jī)會(huì)。人類胚胎培養(yǎng)中也有發(fā)生污染后經(jīng)過處理成功妊娠并分娩的報(bào)道［6-7］。但是出于對(duì)胚胎質(zhì)量的擔(dān)憂和母體感染風(fēng)險(xiǎn)的考慮，目前大多數(shù)中心并不建議移植污染胚胎，因此對(duì)于發(fā)生細(xì)菌污染的IVF周期，首先要確定病原體的種類和來源，針對(duì)不同的污染來源采取相應(yīng)對(duì)策。對(duì)于來自患者精液或卵泡液中的病原體，下次周期前可使用敏感抗生素取卵或取精前預(yù)防用藥，使用含有不同抗生素體系的培養(yǎng)液，如果證實(shí)細(xì)菌來源是精液的病例，可改行ICSI方式受精，避免精液中細(xì)菌接觸到卵子和培養(yǎng)體系從而杜絕污染的可能性［8］。

［1］ Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al.Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer［J］.Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

［2］ 朱桂金，魏玉蘭，胡娟，等.體外受精過程中胚胎污染及其來源的探討［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39：382-384.

［3］ Snyman E，VanderMerwe JV.Endotoxin-pollutedmedium in a human in vitro fertilization program［J］.Fertil Steril，1986，46：273-266.

［4］ Kastrop PM，de Graaf-Miltenburg LA，Gutknecht DR，et al.Microbial contamination of embryo cultures in anART laboratory：sources and management［J］.Hum Reprod，2007，22：2243-2248.

［5］ 魯振宇，張?jiān)粕?，糜若?胚胎發(fā)育對(duì)囊胚形成的影響［J］.天津醫(yī)藥，2010，38：257-259.

［6］ 羅清炳，楊梅，王華，等.體外受精過程中胚胎污染的臨床結(jié)局分析（附精液反復(fù)污染改行ICSI妊娠一例）［J］.優(yōu)生與優(yōu)育雜志，2009，17：115-116.

［7］ 李俐琳，李穗萍，林雯青，等.人類胚胎體外培養(yǎng)細(xì)菌污染12例分析［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012，12：1106-1107.

［8］ Seidman DS，Madjar I，Levron J，et al.Testicular sperm aspirationandintracytoplasmic sperm injection forpersistent infection of the ejaculate［J］.Fertil Steril，1999，71：564-566.