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    FKBP52在反復(fù)體外受精種植失敗患者種植窗期子宮內(nèi)膜的表達(dá)研究

    2014-11-26 08:23:16譚真彭麗英朱文杰賴寶玲付志紅李雪梅唐雪蓮
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2014年7期
    關(guān)鍵詞:體外受精胚胎內(nèi)膜

    譚真,彭麗英,朱文杰,賴寶玲,付志紅,李雪梅,唐雪蓮

    (南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院,深圳 518048)

    提高胚胎種植率是體外受精(IVF)助孕技術(shù)的一大挑戰(zhàn)。胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎種植的兩大重要因素,尋求預(yù)測(cè)與評(píng)估子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎容受性的客觀方法,有助于減少胚胎移植的盲目性[1]。近年來使用基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)描繪了胚胎種植窗期人子宮內(nèi)膜的基因和蛋白的表達(dá)圖譜,為使用生化標(biāo)志物預(yù)測(cè)種植期子宮內(nèi)膜容受性提供了有利條件。

    已有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)KBP52與孕激素受體(PR)結(jié)合能大大提高孕酮(P)與PR的親和力,增強(qiáng)PR活性,尤其是種植窗期FKBP52在子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)空特異性[2-3]。Tranguch等[4-5]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)KBP52基因敲除小鼠胚胎植入完全失敗,提示FKBP52是影響胚胎植入和子宮內(nèi)膜容受性的非常重要的蛋白。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)FKBP52的研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,且FKBP52在種植期的細(xì)胞定位和定量表達(dá)尚不明確。本研究檢測(cè)FKBP52蛋白在人子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況,探討其與人子宮內(nèi)膜容受性之間的關(guān)系,為臨床提高胚胎種植率提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    資料與方法

    一、研究對(duì)象

    選擇2013年8月至2014年3月在我院生殖中心接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療、連續(xù)3周期并移植至少6個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲得臨床妊娠者20例(研究組)。同期募集正常女性志愿者15例(對(duì)照組),要求其近年有正常生育史,無卵巢手術(shù)史,3個(gè)月內(nèi)無激素治療及宮腔操作史;無子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水、子宮肌瘤、子宮腺肌瘤或多囊卵巢綜合征等疾病。所有參與者年齡25~35歲,月經(jīng)規(guī)律,基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常,B超顯示正常子宮形態(tài),卵泡晚期內(nèi)膜三線征明顯,厚度≥8mm。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有參與者簽署知情同意書。

    二、研究方法

    1.監(jiān)測(cè)排卵和分組:入組者于月經(jīng)第10天開始陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育,至卵泡直徑達(dá)15mm以上時(shí),每天檢測(cè)卵泡大小及尿黃體生成素(LH)峰監(jiān)測(cè)排卵,尿LH峰日為卵泡晚期,排卵+7d為種植窗期,收取研究組婦女種植窗期子宮內(nèi)膜標(biāo)本(組1),并分別收取對(duì)照組卵泡晚期(組2)和種植窗期(組3)的子宮內(nèi)膜標(biāo)本。

    2.標(biāo)本采集和處理方法:用直徑0.3cm的內(nèi)膜取樣器(GYNETICS,比利時(shí))采集子宮腔中段內(nèi)膜標(biāo)本,置于4℃生理鹽水,洗去血污,干紗布?jí)K吸去水分后分成2份:1份迅速放入-80℃冰箱中保存,用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè);1份放入4%甲醛中固定,用于免疫組織化學(xué)測(cè)定,同日抽血測(cè)定血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平。

    3.RT-PCR檢測(cè):采用 Trizol試劑盒(Invitrogen,美國(guó))提取子宮內(nèi)膜組織總RNA,并測(cè)量其RNA濃度及純度,控制A260/A280在1.8~2.0范圍。采用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Fermentas,加拿大)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,取總RNA 2μg,OligodT18 1μl逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)總體積20μl。FKBP52引物序列:上游 5′-CATTGCCATAGCCACCATGAA-3′,下游5′-TCCAGTGCAACCTCCACGATA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度252bp。同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參,其引物序列上游為5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′,下游為5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度475bp,引物均由南京金思瑞公司合成。PCR反應(yīng)條件:95℃3min預(yù)變性,94℃20s變性,59℃20s退火,72℃30s延伸,共40個(gè)循環(huán)。監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù),自動(dòng)計(jì)算軟件融點(diǎn)曲線分析,采用ABI7300型PCR儀(ABI,美國(guó))檢出結(jié)果。按下列公式計(jì)算樣本中FKBP52mRNA 的相對(duì)表達(dá)量[6]:△Ct(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因);△△Ct=△Ct(待測(cè)樣本)-△Ct(參照樣本);目的基因的相對(duì)表達(dá)量為2-△△Ct。

    4.免疫組織化學(xué)檢測(cè):標(biāo)本按常規(guī)脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行包埋成石蠟塊。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法)檢測(cè)FKBP52蛋白的表達(dá)及定位。操作方法按SP法試劑盒(北京中杉金橋)說明書進(jìn)行。石蠟切片厚3μm,常規(guī)脫蠟、水化、封閉,滴加一抗。一抗為兔抗人FKBP52多克隆抗體(Abcam,英國(guó)),工作稀釋度1∶100,4℃冰箱過夜。再滴加羊抗兔IgG(SP-9001,北京中杉金橋)二抗,3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB,武漢博士德)顯色,蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹膠封片。陽性表達(dá)為細(xì)胞核或細(xì)胞漿染成黃色或棕黃色。陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。每張切片在顯微鏡(Olympus,日本)下隨機(jī)選取互不重復(fù)的5個(gè)視野(×400倍),采用Image-proplus6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,測(cè)定每個(gè)視野的積分光密度值(IOD),求其平均值,記為FKBP52蛋白的表達(dá)量。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    一、各組的一般情況比較

    對(duì)照組(組2、3)和研究組(組1)的平均年齡、體重指數(shù)(BMI)、月經(jīng)周期、基礎(chǔ)的卵泡刺激素(FSH)、LH、E2、P、泌乳素(PRL)和睪酮(T)及黃體期的E2、P水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為 0.463、0.618、0.809、0.404、0.328、0.504、0.517、0.660、0.187、0.664和0.305)(表1)。

    表1 對(duì)照組和研究組的一般情況(±s)

    表1 對(duì)照組和研究組的一般情況(±s)

    組 別 例數(shù) 平均年齡(歲) BMI(kg/m2) 月經(jīng)周期(d)基礎(chǔ)性激素水平FSH(U/L) LH(U/L)對(duì)照組 15 32.7±2.9 21.91±2.63 31.0±3.7 7.48±1.63 4.53±1.77研究組 20 33.3±3.1 22.17±2.40 31.3±3.0 7.79±1.44 4.05±1.64組 別 例數(shù)基礎(chǔ)性激素水平 黃體期激素水平E2(pmol/L) P(nmol/L) PRL(nmol/L) T (nmol/L) E2(pmol/L) P(nmol/L)對(duì)照組 15 179.93±65.40 2.38±1.49 9.88±3.30 1.25±0.45 859.37±200.57 70.31±26.09研究組 20 157.97±77.96 2.16±1.43 15.46±7.71 1.39±0.45 811.42±278.49 60.77±20.26

    二、FKBP52mRNA的表達(dá)情況

    在實(shí)驗(yàn)過程中,采用RT-PCR檢測(cè),在三組中均有FKBP52mRNA表達(dá),F(xiàn)KBP52基因和內(nèi)參基因GAPDH的溶解曲線峰均為特異的單峰,熔點(diǎn)溫度(波峰對(duì)應(yīng)的溫度)分別為85.7℃和88.5℃,表明擴(kuò)增產(chǎn)物有特異性。組1的平均FKBP52mRNA表達(dá)水平低于組3,組2的FKBP52mRNA表達(dá)值亦低于組3,但三組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

    表2 不同組FKBP52mRNA表達(dá)量及蛋白IOD值結(jié)果(±s)

    表2 不同組FKBP52mRNA表達(dá)量及蛋白IOD值結(jié)果(±s)

    注:與組3比較,*P<0.05,**P<0.01

    組 別 例數(shù) FKBP52mRNA FKBP52蛋白IOD值1 20 1.85±1.01 2 125.9±1 729.9*2 15 2.29±2.13 1 360.2±853.7**3 15 3.38±3.14 8 319.7±5 873.8

    三、FKBP52蛋白的表達(dá)及定位情況

    免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,F(xiàn)KBP52蛋白主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮的胞核及胞漿,間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)極少。組1以胞核表達(dá)明顯(圖1A),組2以胞漿表達(dá)明顯(圖1B),組3中胞核及胞漿均表達(dá)明顯(圖1C)。Image-proplus6.0軟件圖像分析結(jié)果,組3的平均IOD值顯著大于組1(P<0.05)和組2(P<0.01)(表2)。

    四、FKBP52mRNA及蛋白的表達(dá)與黃體期E2、P的關(guān)系

    統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示:子宮內(nèi)膜FKBP52 mRNA的表達(dá)與雌、孕激素水平無相關(guān)性(r=0.340,P=0.436;r=0.201,P=0.413),F(xiàn)KBP52蛋白的表達(dá)與雌、孕激素水平也無相關(guān)性(r=0.283,P=0.367;r=0.240,P=0.394)(表3)。

    圖1 FKBP52蛋白在3組的表達(dá)情況(SP法+蘇木素復(fù)染 ×400)

    表3 種植窗期FKBP52表達(dá)量與E2、P的關(guān)系

    討 論

    在IVF-ET過程中,常常好的胚胎質(zhì)量、好的內(nèi)膜、好的激素水平情況下仍然會(huì)發(fā)生不明原因的反復(fù)種植失敗,而對(duì)之臨床上依然缺乏有效的解決手段。近年來從分子生物學(xué)角度探尋其中關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)以作為標(biāo)志物,旨在指導(dǎo)臨床成為目前研究的熱點(diǎn)。

    自1985年第1次發(fā)現(xiàn)FKBP52蛋白以來,越來越多的研究者重視FKBP52的研究。Lebeau等[7]研究發(fā)現(xiàn),從兔肝臟中克隆出FKBP52的cDNA序列,能使FKBP52結(jié)合甾體激素受體,調(diào)節(jié)激素受體功能,增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路。Dey等[8]研究發(fā)現(xiàn),缺少PR的小鼠可見排卵、受精和種植失敗,但在FKBP52基因敲除的小鼠僅由于缺乏子宮內(nèi)膜容受性而引起種植失敗。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究,發(fā)現(xiàn)人子宮內(nèi)膜FKBP52在“種植窗”前期和“種植窗”期的表達(dá)存在差異[9]。FKBP52在子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎容受性起著重要作用,不管動(dòng)物還是人類,相繼得到了證明。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)反復(fù)體外受精種植失敗患者子宮內(nèi)膜上FKBP52的表達(dá)的相關(guān)因素進(jìn)行研究,以正常婦女“種植窗”前期和“種植窗”期為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)“種植窗”前期和“種植窗”期FKBP52蛋白均有表達(dá),其主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮的胞核及胞漿,間質(zhì)細(xì)胞幾乎無表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道,胚胎植入過程中FKBP52首先定位于胞漿,與PR結(jié)合形成復(fù)合物,再由胞漿內(nèi)的動(dòng)力蛋白快速轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核與P結(jié)合調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)[10]。本研究顯示,正常婦女子宮內(nèi)膜FKBP52蛋白于胞漿和胞核均有表達(dá),與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致;而反復(fù)體外受精種植失敗患者種植窗期FKBP52蛋白的表達(dá)僅定位于胞核,有別于正常的定位模式,或許這是不能成功種植的原因之一。

    本組免疫組化結(jié)果還顯示,反復(fù)體外受精種植失敗患者子宮內(nèi)膜FKBP52蛋白的表達(dá)顯著低于正常育齡婦女,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。胚胎種植是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程,這一過程在特定的時(shí)空范圍內(nèi)發(fā)生,即“種植窗”。種植窗期一系列細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子等復(fù)雜而又精確的定位和變化以及胚胎與子宮內(nèi)膜容受性之間非??b密的對(duì)話機(jī)制是胚胎成功植入的關(guān)鍵[11]。本研究結(jié)果提示,反復(fù)體外受精種植失敗患者子宮內(nèi)膜FKBP52蛋白的異常定位及低表達(dá)可能影響了胚胎與子宮內(nèi)膜之間的精密對(duì)話,從而導(dǎo)致種植失敗,但其具體影響機(jī)制尚不清楚,還有待進(jìn)一步研究。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致,從不同側(cè)面反映了FKBP52表達(dá)與子宮內(nèi)膜容受性的緊密相關(guān)性,推測(cè)FKBP52表達(dá)異常是胚胎種植失敗的重要相關(guān)因素。而FKBP52表達(dá)與血清雌孕激素高低無顯著相關(guān)性,今后應(yīng)加大研究的樣本量,并需進(jìn)一步闡明子宮內(nèi)膜雌孕激素受體與FKBP52蛋白表達(dá)之間關(guān)系,以對(duì)結(jié)論作進(jìn)一步驗(yàn)證。

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