豬APOBEC3F 基因外顯子8 單核苷酸的多態(tài)性及其與豬繁殖和呼吸綜合征病毒易感性的關(guān)聯(lián)性

朱前明，孟春花， 茆達(dá)干， 王慧利， 李靜心， 王 婧1，， 王亞磊1，，

曹少先1，3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京210095;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物品種改良和繁育重點實驗室，江蘇 南京210014)

載脂蛋白質(zhì)B mRNA 編輯酶催化多肽3F(APOBEC3F)是APOBEC 家族的一員，具有廣泛的抗病毒活性，可有效地抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)等病毒的復(fù)制，在宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用［1-4］。APOBEC3F 含有2 個相同的胞嘧啶脫氨基模體即His/Cys-X-Glu-X23-28-Pro-Cys-X2-Cys，分別位于基因編碼蛋白質(zhì)的第85 ～119 位和265 ～299 位。C 端脫氨基模體是其發(fā)揮脫氨基作用的主要活性區(qū)域，N 端模體脫氨基作用較弱，主要與APOBEC 分子衣殼化、RNA 結(jié)合及二聚體的形成有關(guān)，但兩者都是發(fā)揮脫氨基功能必不可少的部分［5-8］。其主要作用機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)APOBEC3F 分子通過gag 蛋白質(zhì)［6］、病毒RNA［7］、細(xì)胞RNA［8］的媒介進(jìn)入成熟病毒粒子的核心，并在隨后感染的靶細(xì)胞中使新合成的負(fù)鏈cDNA 發(fā)生C/T 突變，從而導(dǎo)致新合成的DNA 降解或產(chǎn)生大量致死性的G/A 突變來抑制病毒的復(fù)制與感染［9-12］。

有研究結(jié)果表明APOBEC3F基因的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒特性具有普遍性［13-14］。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種高度傳染性疾病。2006 年中國南方暴發(fā)的豬高熱病對中國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其病原就是變異的高致病性PRRSV［15-16］。通過分離豬肺泡巨噬細(xì)胞體外攻毒PRRSV 的方法來分析豬PRRSV 易感性差異是一種有效的試驗?zāi)Ｐ停?7］。豬APOBEC3F基因雖然已經(jīng)被克?。?8-19］，但關(guān)于APOBEC3F基因的多態(tài)性及其與PRRSV 易感性的關(guān)聯(lián)研究尚未見報道。本研究對多個豬種APOBEC3F基因外顯子3、4、8 和內(nèi)含子3 進(jìn)行測序，尋找多態(tài)性位點，并分析其與PRRSV 易感性的關(guān)聯(lián)性，以期檢測到與PRRSV 易感性相關(guān)的分子標(biāo)記，為抗PRRSV 豬育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗豬包括9 個品種，共193 頭，其中杜洛克豬36 頭(購自杭州大關(guān)豬場)、長白豬42 頭(購自杭州大關(guān)豬場)、大白豬38 頭(購自杭州大關(guān)豬場)、蘇鐘豬34 頭(購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)基地豬場)、姜曲海豬14 頭(購自江蘇姜曲海豬場)、定遠(yuǎn)豬12 頭(購自安徽定遠(yuǎn)縣豬場)、二花臉豬5 頭(購自江蘇省常熟市畜禽良種有限責(zé)任公司)、梅山豬5 頭(購自江蘇太倉市種豬場)、三元雜交豬7 頭(購自鎮(zhèn)江丹徒區(qū)云立牧業(yè)有限公司)。每個個體取耳組織于凍存管中，置于液氮中保存。PRRSV NJGC 株由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 組織樣DNA 提取 耳組織樣的DNA 提取采用酚/氯仿抽提法，TE buffer 溶解后，-20 ℃保存。

1.2.2APOBEC3F基因外顯子3、4 和8 擴(kuò)增 參照豬APOBEC3F基因外顯子3、4、8 和內(nèi)含子3 序列分別設(shè)計A3F-A、A3F-B 2 對引物，由上海捷瑞公司合成，引物信息見表1。PCR 反應(yīng)總體系20.0 μl，其中含模板DNA 為60 ng，2.5 U/μl PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 為0.2 μl，2 mmol/L dNTPs 為1.6 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，5× Prime-STAR?Buffer(包含Mg2+)為4.0 μl，最終加滅菌蒸餾水至20.0 μl。

PCR 反應(yīng)程序:98 ℃變性10 s;各引物最適溫度復(fù)性5 s，72 ℃延伸1 min 20 s，35 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 多態(tài)位點的測序和篩選 每6 頭豬DNA 等量混合構(gòu)建DNA 池，構(gòu)建3 個不同的DNA 池，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳純化后的PCR 產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.4 PCR-RFLP 分析 根據(jù)測序結(jié)果選擇外顯子8 的5 bp 處的多態(tài)位點，建立PCR-RFLP 檢測方法，引物Nrul-SNP 序列見表1。PCR 反應(yīng)總體系20.0 μl，含模板DNA 60 ng，Taq聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.4 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.4 μl，10 ×緩沖液2.0 μl，加滅菌蒸餾水至20.0 μl。PCR 擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，引物最適溫度復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，檢測擴(kuò)增結(jié)果。

用Nrul酶對引物Nrul-SNP 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型。酶切反應(yīng)體系為16.0 μl:含PCR 產(chǎn)物5.0 μl，Nrul(10 U/μl)0.5 μl，10 × T buffer 1.0 μl，滅菌蒸餾水9.5 μl，37 ℃反應(yīng)4 h。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，EB 染色，培清JS-780 全自動凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照分析。

1.2.5 PRRSV 易感性測定 參照Ait-Ali 等［17］的方法進(jìn)行。簡要步驟如下:分離豬肺泡巨噬細(xì)胞，接種PRRSV 病毒，分別在接毒后6 h、12 h、18 h、24 h和36 h 收集細(xì)胞，提取RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對β-actin基因、PRRSV 毒株N基因序列分別設(shè)計特異性引物β-actin和PRRSV-N(表1，由上海捷瑞公司合成)。以cDNA 為模板PCR 擴(kuò)增基因片段，克隆至T 載體，以此為模板，SYBR Green I 染料法進(jìn)行定量PCR(ABI7300)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以PRRSVN基因的拷貝數(shù)與β-actin基因拷貝數(shù)的比來計算病毒載量，作為易感性的參數(shù)。每組3 個重復(fù)。反應(yīng)體系為20.0 μl，其中SYBR PremixEx Taq10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μl，ROX 0.4 μl，模板2.0 μl，滅菌去離子水6.4 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s，56 ℃31 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光信號。

表1 引物信息Table 1 The information of primers used in this study

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 不同豬種群體不同基因型的PRRSV 易感性數(shù)據(jù)分別用SPSS17.0 軟件的One-Way ANOVA 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 APOBEC3F 基因片段的擴(kuò)增及SNP 篩選

對豬APOBEC3F基因內(nèi)含子3 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在1 000 ～2 000 bp 間出現(xiàn)1 條特異性條帶(圖1)與預(yù)期結(jié)果一致。對豬APOBEC3F基因外顯子8 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 000 ～2 000 bp 間出現(xiàn)1 條特異性條帶(圖2)與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果顯示，在內(nèi)含子3 的16 bp 處出現(xiàn)1 個A/G 突變(圖3)。在外顯子8 的5 bp處出現(xiàn)1 個G/A 突變(圖4)。經(jīng)分析外顯子8 的5 bp處出現(xiàn)G/A 突變處于Nrul酶切位點內(nèi)，而內(nèi)含子3 的16 bp 處A/G 突變引物不易設(shè)計，即使用人為創(chuàng)造酶切位點的方法也不能找到合適的限制性內(nèi)切酶。

2.2 PCR-RFLP 分析

針對外顯子8 的5 bp 處G/A 的單堿基突變設(shè)計特異性引物，命名為Nrul-SNP。對豬DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在500 bp 與750 bp 之間得到1 條特異性條帶(圖5)，與預(yù)期結(jié)果一致。用限制性內(nèi)切酶Nrul對引物Nrul-SNP 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型，以PCR 產(chǎn)物作為對照電泳，AA 型為1 個572 bp片段;GG 型為379 bp 和193 bp 2 個片段;GA 型為572 bp、379 bp 和193 bp 3 個片段(圖6)。

圖1 豬APOBEC3F 基因內(nèi)含子3 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification of APOBEC3F intron three

圖2 豬APOBEC3F 基因外顯子8 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification of APOBEC3F exon eight

圖3 APOBEC3F 基因內(nèi)含子3 單堿基突變Fig.3 Single-base mutation in intron three of APOBEC3F gene

圖4 APOBEC3F 基因外顯子8 單堿基突變Fig.4 Single-base mutation in exon eight of APOBEC3F gene

圖5 Nrul-SNP 引物PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 PCR amplification with primer Nrul-SNP

2.3 APOBEC3F 基因群體的遺傳特征

2.3.1 基因頻率及基因型頻率在豬群體中的分布

在各豬種群體中外顯子8 的5 bp 處可以檢測到3種基因型，以GG 型居多，GA 型次之，AA 最少;定遠(yuǎn)豬和梅山豬群體中檢測到3 種基因型;二花臉豬群體中檢測到GG 和GA 2 種基因型;其他豬群體只檢測到GG 1 種基因型。在所有被檢測豬種群體中，G等位基因的頻率均高于A等位基因，因此G為優(yōu)勢等位基因(表2)。

圖6 PCR 產(chǎn)物的Nrul 酶切分型Fig.6 Identification of PCR products with Nrul

表2 APOBEC3F 基因外顯子8 的5 bp 處基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳特征Table 2 Genotypic frequency and allelic frequency at 5 bp of exon eight of APOBEC3F gene and population inheritance character

表3 不同基因型豬PAM 接毒后PRRSV 拷貝數(shù)Table 3 The relative amount of PRRSV in porcine alveolar macrophage(PAM)of different genotypes of pig

2.3.2 遺傳特性 外顯子8 的5 bp 處在定遠(yuǎn)豬、梅山豬和二花臉豬群體中為中度多態(tài)(0.25 ＜PIC＜0.50)，而在其他群體中未表現(xiàn)出多態(tài)性，表明該多態(tài)位點在定遠(yuǎn)豬、梅山豬和二花臉豬群體中存在較強(qiáng)的選擇潛力(表2)。采用χ2適合性檢驗檢測發(fā)現(xiàn)該基因座位在定遠(yuǎn)豬、二花臉豬和梅山豬群體中均未偏離Hardy-Weinberg 平衡(P＞0.05)。

2.4 不同基因型豬種群PRRSV 易感性

比較APOBEC3F基因外顯子8 的5 bp 處不同基因型豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)接毒后PRRSV 拷貝數(shù)(表3)發(fā)現(xiàn)，AA 基因型豬PAM 細(xì)胞接毒后12 h PRRSV 拷貝數(shù)顯著高于GG 型(P＜0.05)，極顯著高于GA 基因型(P＜0.01)。

3 討論

大量研究結(jié)果表明APOBEC3F基因具有抑制HIV［1］、PERV［3］、MLV［20］等反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的作用。Jonsson 等［14］研究發(fā)現(xiàn)偶蹄動物牛、羊和豬APOBEC3F 主要定位在細(xì)胞質(zhì)，并能抑制HIV-1 和MLV 的復(fù)制。王雄虎等［21］研究發(fā)現(xiàn)APOBEC3F基因第4 外顯子536 位點T/C 突變可能與感染HBV易感性有關(guān)。而豬APOBEC3F基因多態(tài)性及其與PRRSV 抗性相關(guān)性的研究尚未見報道。本研究以APOBEC3F基因為候選基因，結(jié)合DNA 池PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序方法，發(fā)現(xiàn)了豬APOBEC3F基因2 個單堿基突變(內(nèi)含子3 的16 bp 處出現(xiàn)A/G 突變和外顯子8 的5 bp 處出現(xiàn)G/A 突變)。外顯子8 的5 bp處可以檢測到3 種基因型，以GG 型居多，GA 型次之，AA 最少，且該位點多態(tài)性在不同豬種間存在明顯的差異。其他種豬群體中沒有多態(tài)性，可能與長期的人工選育有關(guān)。內(nèi)含子3 的16 bp 處的A/G 突變找不到合適的限制性內(nèi)切酶來設(shè)計PCR-RFLP 或者CRS-PCR-RFLP 方法，因此該位點還需探索其他的檢測方法以進(jìn)一步研究。

比較外顯子8 的5 bp 處不同基因型豬PAM 細(xì)胞接毒后PRRSV 拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，AA 型豬PAM 細(xì)胞接毒后12h PRRSV 拷貝數(shù)顯著高于GG 基因型(P＜0.05)，極顯著高于GA 基因型。表明AA 型豬PRRSV 易感性高于GG 型和GA 型，提示G等位基因更有利于抵抗PRRSV 的感染。

通過數(shù)據(jù)庫查詢對比可以得出，本研究檢測到外顯子8 的5 bp 處G/A 突變是有義突變，導(dǎo)致APOBEC3F基因所編碼蛋白質(zhì)的第391 位的丙氨酸(Ala)變成蘇氨酸(Thr)。有研究結(jié)果［12］顯示APOBEC3F 含有兩個胞嘧啶脫氨基模體，并且C 端脫氨基模體是其發(fā)揮脫氨基作用的主要活性區(qū)域，N 端模體脫氨基作用較弱，主要與APOBEC 分子衣殼化、RNA 結(jié)合及二聚體的形成有關(guān)。雖然該處的氨基酸改變不在脫氨基結(jié)構(gòu)域上，但有研究顯示失去胞苷脫氨基作用的APOBEC3F 分子依然具有抗病毒作用［22］，APOBEC3F 分子的脫氨基模體是其發(fā)揮抗病毒作用的分子基礎(chǔ)，但并不是其抗病毒作用的唯一途徑。A5T 突變是否通過其他途徑改變APOBEC3F 的抗病毒作用還有待進(jìn)一步研究和探討。

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