TGF-β1對鼠肌成纖維細胞增殖和分泌1型膠原的影響

鄧長柏，賀 亮，孫鳳杰，李 娟

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510700)

支氣管肺發(fā)育不良(bronchial pulmonary display，BPD)是早產(chǎn)兒常見的疾病，隨著早產(chǎn)兒發(fā)生率的增加和機械通氣應(yīng)用的增多，BPD 患兒也越來越多，其病理表現(xiàn)為肺血管的發(fā)育障礙和肺的纖維化。肺纖維化表現(xiàn)為肺泡細胞破壞和間質(zhì)細胞(成纖維細胞)增殖，分泌更多的細胞外基質(zhì)。多種因素可導(dǎo)致成纖維細胞活化增殖，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factors-β1，TGF-β1)是最主要的細胞因子，其致肺纖維化的作用機制值得研究。本文采用培養(yǎng)的成纖維細胞株C212，經(jīng)TGF-β1 干預(yù)，檢測其細胞增殖和分泌細胞外基質(zhì)，研究其作用機制，具有一定作用。

1 材料和方法

1.1 試劑、儀器

DMEM 培養(yǎng)液(Hyclone 公司生產(chǎn))，小牛血清(杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品)，TGF-β1 試劑為美國Peprotech 公司生產(chǎn)(1μg/mL)，辣根過氧化物酶，羊抗免IgG 2 抗體(博士德公司生產(chǎn))(－4℃保存)，胰酶，牛血清白蛋白(BSA)、DEPC、PMSF 和考馬斯亮蘭R-250 均購于美國Sigma 公司，MTT(250mg/支、Amresco 公司生產(chǎn)，配成5mg/mL 的MTT/PBS 溶液)，3H-Thymidine:(購于中國原子能研究所，0.2μCi/μL)。3350 型酶聯(lián)免疫檢測儀(德國Beckman 公司生產(chǎn))，LS6500 型液體閃爍計數(shù)器(德國Beckman 公司生產(chǎn))，6 孔培養(yǎng)板、96 孔培養(yǎng)板、24 孔培養(yǎng)板(均為美國Costar 公司生產(chǎn))。Ⅰ型膠原ELISA 試劑盒(美國Metra CICP，Quidel Corporation 生產(chǎn))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid K1621，F(xiàn)ermentas 公司生產(chǎn))，Trizol 試劑(TRI-Reagent，美國GiBCO 生產(chǎn))，引物(華大基因-上海鼎安生物公司生產(chǎn))，Taq 酶(100u/支)(Promega 公司生產(chǎn))。主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(美國SHEL-LAB 公司生產(chǎn))，醫(yī)用凈化工作臺(YJ-875，蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn))，倒置顯微鏡(Olympus 公司生產(chǎn))，圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司生產(chǎn))，PCR 擴增儀(美國Perkin Elmer 公司生產(chǎn))，凝膠影像分析儀(Jeldoc 2000型，美國Bio-Rad 公司生產(chǎn))，γ 射線計數(shù)儀(中科院核物理研究所生產(chǎn))。

1.2 試驗方法

鼠肺成纖維細胞株C2C12 細胞培養(yǎng):C2C12 細胞系(由中南大學(xué)病理生理教研室提供)，用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃，5%CO2，恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備細胞懸液進行實驗。

MTT 測定TGF-β1 作干預(yù)后的細胞增殖:制成單細胞懸液后，以每孔1 ×104個細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μL。將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，在37℃、5%CO2及恒溫恒濕條件下，培養(yǎng)24 h;用無血清的DMEM 培養(yǎng)液洗細胞1-2 次;加無血清DMEM 培養(yǎng)液和TGF-β1(使終濃度成0、1、5、10ng/mL)，再培養(yǎng)24 h;加入MTT 溶液(5mg/mL)20μL/孔37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。再在每孔中加入DMSO 150μL，振蕩10min，使甲臜充分溶解。選擇490nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果(OD值)。每一濃度做5 個復(fù)孔，計算平均值。

3H-Thymidine 測定TGF-β1 干預(yù)后細胞增殖:制成單細胞懸液后，以每孔1 ×104個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL。將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，在37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;用無血清DMEM 培養(yǎng)液洗細胞1 ～2 次;加無血清DMEM 培養(yǎng)液和TGF-β1(使終濃度成0、1、5、10ng/mL)再培養(yǎng)24 h;在每孔加入3H-Thymidine 5μL(1μCi/孔);繼續(xù)培養(yǎng)8h，取出培養(yǎng)板，用Hanks 溶液洗滌2 次;在每孔加入2mL 預(yù)冷10%三氯乙酸洗滌;在4℃下放置5 min，共2 次。吸去上清液，再在每孔加入0. 5 mL 0. 3M NaOH;在60℃下放置30 min，混勻，移入閃爍瓶中;每瓶加入3 mL 閃爍液，用液體閃爍計數(shù)儀測定每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。每一濃度做5 個復(fù)孔，計算平均值。

Ⅰ型膠原的檢測:不同濃度(0、1、5、10 ng/mL)TGF-β1 干預(yù)細胞24 h，抽提RNA，做RT-PCR(具體步驟按分子生物學(xué)試驗指南);取細胞培養(yǎng)上清液用ELISA 檢測Ⅰ型膠原，方法步驟按ELISA 試劑盒操作說明進行。

表1 Ⅰ型膠原PCR 引物序列和產(chǎn)物長度

1.3 統(tǒng)計方法

計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析F 檢驗，多組間兩兩比較采用方差分析SNK-q 檢驗，P ＜0.05 為差別有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS 11.5 for windows 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，分析前均進行了方差齊性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 干預(yù)細胞增殖

0、1、5、10ng/mL TGF-β1 干預(yù)細胞24 h，促進細胞增殖。其MTT(OD 值)分別是0. 096、0. 177、0.240、0. 312;［3H］(cpm/min)分別是630、907、1493、1808，隨著TGF-β1 濃度增大，其MTT 值和［3H］值也相應(yīng)增大。詳細結(jié)果見表2。

表2 TGF-β1 干預(yù)細胞增殖結(jié)果

2.2 TGF-β1 對細胞分泌和表達Ⅰ型膠原影響

0、1、5、10 ng/mL TGF-β1 干預(yù)C2C12 細胞24 h，用ELISA 法檢測Ⅰ型膠原結(jié)果(CICP、ng/mL)為616、713、783、853;半定量RT-PCR 檢測Ⅰ型膠原/β-actin 光密度比值分別是0.93、1.83、2.50、2.94。隨著TGF-β1 作用濃度增加而表達增強，呈劑量依賴性。具體結(jié)果見表3。

表3 TGF-β1 干預(yù)細胞24 h Ⅰ型膠原分泌和表達結(jié)果

3 討論

隨著早產(chǎn)兒出生率的增加，BPD 的發(fā)生也有增加。對于BPD 的發(fā)病機制的研究可以幫助我們更好認識該疾病的發(fā)生發(fā)展，為預(yù)防和治療提供策略。2005年中國新生兒學(xué)會流行病學(xué)報道我國城市早產(chǎn)兒出生率高達7. 76% (國外報道多在4% ～9%)，BPD 的研究勢在必行。BPD 的發(fā)病機制是多因素的，早產(chǎn)是其首要因素，胎齡大于32 周的早產(chǎn)兒極少發(fā)生BPD，出生體重和胎齡是其發(fā)生最重要的預(yù)測因素［1］;其次，機械通氣和氧毒性是其發(fā)生的另一因素，避免過多的用氧和機械通氣可減少其發(fā)生率和嚴重程度［2］;炎癥和感染也是其重要的發(fā)病因素，炎癥因子和抗炎因子扮演著重要的角色，是公認的致纖維化的細胞因子，研究表明BPD 胎兒猴肺TGF-β1 明顯增加［3］。但TGF-β1 在BPD 發(fā)病中的作用和機制不清，有研究報道TGF-β1 可使支氣管內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，腫瘤壞死因子加劇其轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肺纖維化［4］。TGF-β1 對肺成纖維細胞增殖和1 型膠原分泌的具體研究國內(nèi)報道較少，本文通過TGF-β1 對小鼠肺成纖維細胞的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其細胞生長呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著TGF-β1 濃度的增加而增加;其分泌1 型膠原及其基因表達也呈劑量依賴性，隨著TGF-β1 濃度的增加而增加。通過此實驗研究說明TGF-β1 在致纖維化的過程中起直接的作用。多種因素可以導(dǎo)致TGF-β1 升高，Sakurai研究發(fā)現(xiàn)高氧引起的肺損傷時TGF-β1 升高，阻斷TGF-β1 信號通路可以阻滯其肺損傷，減輕纖維化［5］。因此，阻斷TGF-β1-成纖維細胞增殖信號通路可能成為早產(chǎn)兒BPD 的治療靶標，為防治BPD的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)，因此該實驗研究具有一定的臨床意義。

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