垂枝櫻花外植體滅菌及不定芽的誘導(dǎo)研究

王紅梅，李園莉，李洪光，董曉輝

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容212400;2.嘉漢城市生態(tài)苗木(蘇州)有限公司，江蘇蘇州215028)

櫻花泛指嗇薇科(Rosaceae)，李亞科(Prunoidea)，櫻屬(Cerasus)觀賞植物，共120余種，是世界著名的木本花卉，櫻花主要分布于亞洲的中國(guó)、日本和朝鮮。我國(guó)古老的西南部高山地區(qū)為櫻屬植物的分布中心、原始種保存中心和特有中心，蘊(yùn)藏著近30種野生櫻花類群，其中很多具有較高的觀賞價(jià)值［1］。

我國(guó)現(xiàn)有櫻花45種，主要有冬櫻花、櫻花、福建山櫻花、云南早櫻、垂枝櫻花等［2］。其中，垂枝櫻花(Cerasus subhirtella Miq.var.pendula Tanaka.)，樹皮灰褐色，冬芽卵形，鱗片先端有疏毛，葉片卵形至卵狀長(zhǎng)圓形，葉邊有鋸齒或缺刻狀鋸齒，葉柄、托葉和鋸齒常有腺體，傘房狀或短總狀花序，花瓣白色或粉紅色，先端圓鈍、微缺或深裂，花期4月，果期6月。產(chǎn)于浙江、安徽、江西、四川、臺(tái)灣省等地，原種產(chǎn)于日本［3］。

觀賞櫻花的引種栽培自20世紀(jì)70年代引起人們的重視，世界各地廣泛栽培櫻花，尤其在日本被奉為國(guó)花［2］。隨著園林化城市的建設(shè)，櫻花苗木供不應(yīng)求，傳統(tǒng)的繁殖方法繁殖速度慢，不能滿足市場(chǎng)的需求，影響了花農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益和櫻花的種植面積［3－4］，而組織培養(yǎng)具有用材少、見效快、可以周年生產(chǎn)等優(yōu)良特點(diǎn)，成為優(yōu)良品種快速繁殖的有效途徑。

為進(jìn)一步開發(fā)利用我國(guó)的櫻花資源，擴(kuò)大種植范圍，形成規(guī)模和影響，筆者初步探討垂枝櫻花的外植體滅菌及不定芽誘導(dǎo)的相關(guān)技術(shù)，旨在為垂枝櫻花的組織培養(yǎng)提供相關(guān)技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為櫻花品種“垂枝櫻花”，3～9月分別選取當(dāng)年生帶腋芽莖段，來(lái)源于江蘇句容天王鎮(zhèn)嘉潤(rùn)苗圃。

1.2 方法

1.2.1 材料采集與預(yù)處理。在晴朗天氣條件下，截取垂枝櫻花健壯無(wú)病害嫩枝中上部作為外植體，去掉葉片留葉柄。選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的春梢枝段為材料，對(duì)所采材料及時(shí)接種，防止失水萎蔫或污染霉?fàn)€。

將采集的櫻花材料進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，剪切成2～3 cm小段，每段至少保留1～2個(gè)腋芽，然后將材料放在洗衣粉中浸泡15 min，用流水反復(fù)沖洗1 h。

1.2.2 材料表面滅菌。對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒處理。把外植體剪成1～2 cm長(zhǎng)的莖尖或帶有一個(gè)腋芽的莖段，用70%乙醇處理30 s，然后用0.1%的HgCl2消毒處理 4、5、6、7、8、10、12 min，處理期間不斷搖晃，使材料充分達(dá)到滅菌效果，再用無(wú)菌水沖洗3～4遍。接種前部分切去莖段的兩端，將消毒好的材料剪切成單芽，保留莖段長(zhǎng)約1 cm左右，直立式接種，將外植體基部插入培養(yǎng)基，每瓶接種3個(gè)材料，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次，20 d后分別統(tǒng)計(jì)污染率、褐變率、成活率等指標(biāo)［5－6］。

1.2.3 外植體不同采集時(shí)間的影響。選取3～9月，晴天中午采集當(dāng)年生健壯的外植體，接種于相同的啟動(dòng)培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L 上進(jìn)行培養(yǎng)，接種20 d后，統(tǒng)計(jì)成活率及生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇3個(gè)試驗(yàn)因素，分別為基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、1/4MS)、6-BA(0.1、0.5、1.0 mg/L)、NAA(0.02、0.05、0.10 mg/L)，采用 L9(34)正交設(shè)計(jì)，共 9 種配方，每種培養(yǎng)基里均附加蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH調(diào)至5.8。每種處理接種30瓶，每瓶2棵，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)分化數(shù)和分化率［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間的影響 對(duì)垂枝櫻花不同滅菌時(shí)間的比較見表1。表1表明，在對(duì)外植體表面乙醇滅菌時(shí)間均為30 s的情況下，HgCl2滅菌時(shí)間過低會(huì)導(dǎo)致污染率上升，相反，時(shí)間控制在8～12 min，褐變率和污染率較低，存活率最高達(dá)到68.3%。此外，滅菌時(shí)間也隨采集外植體母株的生長(zhǎng)狀態(tài)及芽的生長(zhǎng)狀況而調(diào)整。芽較嫩時(shí)，滅菌時(shí)間相對(duì)縮短，否則滅菌時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致褐變甚至直接殺死材料，但滅菌時(shí)間過短會(huì)使污染率大大上升，污染率過高將致使成活率接近0［6］。

表1 垂直櫻花表面滅菌效果比較

2.2 外植體不同采集時(shí)間的影響 圖1表明，外植體采集時(shí)間以3～5月份的萌芽率較高，6～8月份較低，9月又有所升高。4月份采集外植體的成活率最高，達(dá)到84%，這是因?yàn)?月份垂枝櫻花期過后，正處于快速的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，不定芽的誘導(dǎo)較易。而6月份后，由于氣溫不斷升高，枝條的木質(zhì)化加速，影響了不定芽的誘導(dǎo)。9月份屬于樹木的秋季生長(zhǎng)期，又有所增加，但萌芽率遠(yuǎn)不如春季。而10月份后到翌年2月份，由于落葉及花芽的形成，基本不適合采集莖段外植體。因此，以莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)適宜的材料采集時(shí)間為每年3～5月份。

圖1 外植體采集時(shí)間與萌芽率的關(guān)系

2.3 不定芽誘導(dǎo)結(jié)果分析 表2表明，基本培養(yǎng)基以大量元素減半的1/2MS基本培養(yǎng)基的分化率最高;隨著6-BA濃度的增加，分化率呈先增后減的趨勢(shì);NAA濃度為0.02 mg/L與0.05 mg/L的分化率差別不大，而0.10 mg/L的分化率最高。從R值可知，3種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響為基本培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA。所試驗(yàn)的配方中以啟動(dòng)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L 較適宜［6－7］。但考慮到啟動(dòng)培養(yǎng)中僅選擇了3個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，各水平間是否存在差異，必須進(jìn)行方差分析。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

方差分析結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基的F=90.976，P=0.011＜0.05，NAA 的 F=21.086，P=0.045 ＜0.05，表明這 2 個(gè)因素對(duì)分化率的影響都達(dá)到顯著水平。因此，需對(duì)這2個(gè)因素進(jìn)行多重比較。使用SPSS19.0中Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明，3種基本培養(yǎng)基之間均達(dá)到顯著差異;NAA的第1個(gè)和第2個(gè)水平間差異不顯著，而與第3個(gè)水平間存在顯著差異。再結(jié)合極差分析結(jié)果，初步得到適宜垂枝櫻花不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為 1/2MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L。由于6-BA的各水平間差異不顯著，所以在進(jìn)一步試驗(yàn)中可加大6-BA各水平的差異，以便尋找分化率更高、生長(zhǎng)效果更好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

3 討論

木本植物組織培養(yǎng)中，初次培養(yǎng)的褐變死亡是普遍存在的問題，在櫻花培養(yǎng)中也如此，材料年齡、取材部位，材料大小、培養(yǎng)條件以及外植體受傷害程度等均能對(duì)褐變產(chǎn)生影響，目前尚無(wú)徹底的解決辦法［8］。

研究表明，選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w以及控制表面滅菌時(shí)間是克服材料褐變的最主要手段，取材長(zhǎng)度適當(dāng)加大，盡可能減小傷口面積，并縮短切口暴露在空氣中的時(shí)間，選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間，如乙醇雖消毒效果較好，但易對(duì)材料造成傷害，導(dǎo)致褐變，HgCl2對(duì)外植體傷害較輕，且消毒時(shí)間越長(zhǎng)，消毒效果越好［9］。

在組培過程中，污染問題也是影響外植體死亡的最重要因素之一，在組培生產(chǎn)過程中，污染主要來(lái)源4個(gè)方面:①植物材料污染;②培養(yǎng)基污染;③接種過程發(fā)生污染;④培養(yǎng)過程發(fā)生污染。針對(duì)污染發(fā)生的來(lái)源，加強(qiáng)控制以降低污染，認(rèn)真對(duì)待表面滅菌過程，降低污染率，對(duì)真菌引起的污染材料，不能再轉(zhuǎn)接，對(duì)細(xì)菌引起的污染可轉(zhuǎn)入生根，但要單獨(dú)轉(zhuǎn)接，防止與其他材料發(fā)生交叉感染［10］。

在不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)中，腋芽分化的發(fā)生也受到多種因素的影響，除受培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等影響外，還受生長(zhǎng)素濃度的影響。該試驗(yàn)中僅對(duì)基本培養(yǎng)基和2種生長(zhǎng)素的濃度進(jìn)行了試驗(yàn)，分化率有待進(jìn)一步提高。所以，在進(jìn)一步研究中可分別對(duì)基本培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)條件以及附加成分進(jìn)行試驗(yàn)，以達(dá)到較好的分化效果［6］。

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