湖北稻瘟病病菌種群鑒定與分析

吳堯+吳雙清+王林+揭春玉

摘要：利用國際水稻研究所（IRRI）30個單基因系品種和中國7個鑒別品種對湖北195個稻瘟?。∕agnaporthe oryzae）菌株進(jìn)行致病型檢測。以單基因系品種抗譜為參數(shù)，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，在相似系數(shù)0.79水平下參試菌株被劃分為18個致病型菌群;Pi-9（t）（mv21）和Pi-z5（mv09）的抗譜分別為83.6%和71.8%，在湖北水稻生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景;根據(jù)中國7個鑒別品種進(jìn)行傳統(tǒng)病菌種群劃分，參試菌株被劃分為7個菌群27個生理小種，其中ZE01和ZB15在本區(qū)域?qū)賰?yōu)勢小種，其次為ZG01和ZC15。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌;病菌種群;鑒定;聚類分析;湖北

中圖分類號：S435.111.4+1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）21-5159-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.027

Identification and Analysis of Magnaporthe Oryzae Populations in Hubei Province

WU Yao， WU Shuang-qing， Wang lin， JIE Chun-yu

（Enshi Autonomous Prefectures Academy of Acultural Sciences， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： 195 Magnaporthe grisea isolates collecting from rice-cropping districts of Hubei province were tested for their pathogenicity against 30 rice monogenic lines （MLs） of IRRI and 7 Chinese differential varieties （DVs）. Based on MLs resistance spectrum， the unweighted pair group method was used with arithmetic mean （UPGMA） clustering analysis. The results showed that the isolates were divided into 18 pathogenic groups at level of coefficient 0.79. The resistance spectrum of Pi-9（t） （mv21） and Pi-z5（mv09） were 83.6% and 71.8%， respectively. There will be good prospects in the rice production in Hubei province. According to 7 Chinese DVs， the isolates were divided into 7 pathogenic groups and 27 physiological races. ZE01 and ZB15 were dominant races in the region， followed by ZG 01and ZC15.

Key words： Hubei province; Magnaporthe oryzae; population; identification; clustering analysis

稻瘟?。∕agnaporthe oryzae）是水稻三大病害之一，在全球水稻產(chǎn)區(qū)都有危害記錄。湖北屬稻瘟病重發(fā)區(qū)，多次出現(xiàn)流行高峰，給水稻生產(chǎn)造成重大損失。目前防治水稻稻瘟病最有效的措施是抗病品種的利用，但是許多抗稻瘟病品種推廣不久就喪失了抗性[1-3]。主要原因是稻瘟病菌生理小種種類的復(fù)雜性與易變異性[4，5]。根據(jù)Flor[6]的基因?qū)蚣僬f，生理小種是代表致病性基因型不同的菌株類群，是根據(jù)菌株對一套具有不同抗病基因品種的致病反應(yīng)型劃分的。自1959年日本建立了第一套由12個秈、粳稻品種組成的稻瘟病菌生理小種鑒別品種后[7]，國際上陸續(xù)建立了十多套鑒別品種，從最初的抗性不同的常規(guī)品種發(fā)展到遺傳背景相同的單基因系品種，這些鑒別品種為稻瘟病種群結(jié)構(gòu)的研究做出了巨大貢獻(xiàn)，但到目前為止這些鑒別品種都存在一定的局限性[8，9]。本研究選用了兩套在國內(nèi)應(yīng)用較廣的鑒別品種（IRRI的30個單基因系品種和中國7個鑒別品種）對湖北稻瘟病生理小種種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，旨在為湖北水稻品種的選育和水稻生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?監(jiān)測品種

IRRI單基因系品種30個，中國鑒別品種7個，見表1。IRRI單基因系鑒別品種由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供，中國鑒別品種為恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥所保存。

1.2 ?參試菌株

參試菌株195個，采集時間為2011年，采集地點(diǎn)為湖北恩施、利川、咸豐、鐘祥、隨州和崇陽等地的32個鄉(xiāng)鎮(zhèn)村落，品種組合覆蓋70個。菌株經(jīng)單孢分離純化。

1.3 ?試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用苗期孢子懸浮液人工噴霧接種，接種和后期隔離誘導(dǎo)發(fā)病均在恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物病鑒大棚內(nèi)進(jìn)行，具體方法如下：

菌株在番茄燕麥培養(yǎng)基上活化，轉(zhuǎn)接到裝有滅菌稻草節(jié)的錐形瓶內(nèi)28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長滿后，用無菌水洗掉表面菌絲，放置于濕紗布上28 ℃保濕培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)孢。3 d后搓洗培養(yǎng)基，雙層紗網(wǎng)過濾，加少量明膠配成孢子懸浮液，明膠濃度0.25%，接種孢子濃度為100倍顯微鏡視野下5個以上。

鑒別材料種子先用0.5%高錳酸鉀溶液浸泡消毒1 h，再用清水沖洗，然后催芽，待種子露白后即可播種;采用穴盤育苗，育苗土為泥炭土和肥沃園土1∶1混合，每穴播2～3粒芽谷，每個監(jiān)測品種播5穴，兩次重復(fù)，中間設(shè)置誘發(fā)行。

秧苗到三葉期時即可接種，接種前3 d追施一次尿素。接種噴霧量控制在35 mL/m2，接種時及接種后進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)隔離，以防污染干擾。接種后保持25～28 ℃，高濕，避光24 h，然后精心管理，視秧苗生長情況酌施尿素。

根據(jù)對照品種發(fā)病情況確定調(diào)查時間，分級標(biāo)準(zhǔn)參考《農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)抗病性鑒定操作規(guī)程》[10]，分抗感兩級，如某品種感病株數(shù)大于5株，該品種記為“S”，反之記為“R”。調(diào)查2次，間隔7 d，以發(fā)病重的數(shù)據(jù)為準(zhǔn)。

試驗(yàn)結(jié)果來自于2013年的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)單基因系鑒別品種的反應(yīng)類型，“S”記為1，“R”記為0，然后利用非加權(quán)組平均法（UPGMA）對參試菌株進(jìn)行聚類分析，劃分菌群，分析軟件使用NTSYSpc 2.1e;生理小種的劃分按照全國稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?30個單基因系鑒別品種對湖北稻瘟病菌菌群的劃分

對195個菌株進(jìn)行聚類分析，在不同相似系數(shù)水平可將菌株劃分為不同數(shù)量的菌群，由于試驗(yàn)存在誤差，當(dāng)相似系數(shù)≤0.79時，不同重復(fù)的同一菌株才能歸為同一菌群，因此相似系數(shù)確定為0.79。在該相似系數(shù)水平下195個菌株被劃分為18個致病型菌群（表2）。G12、G09和G10菌群為優(yōu)勢菌群，出現(xiàn)頻率分別為44.1%、24.1%和10.3%，G01、G11、G15、G17和G18菌群均只出現(xiàn)1次，出現(xiàn)頻率均為0.5%。

通過對G12、G09和G10菌群的致病譜進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，這3個菌群均對mv01、mv02、mv04、mv12、mv13、mv14、mv15、mv16、mv22、mv23、mv25和mv29均具有較高的致病力，所對應(yīng)的抗病稻瘟病基因?yàn)镻i-a、Pi-ks、Pi-ta、Pi-b、Pi-t、Pi-sh、Pi-12（t）、Pi-19（t）、Pi-20和Pi-11，致病率在90%以上。而對mv21表現(xiàn)出較弱的致病力，所對應(yīng)的抗稻瘟病基因?yàn)镻i-9（t），致病率在30%以下。對mv07、mv09、mv10、mv18、mv19、mv24、mv26、mv27和mv30所表現(xiàn)出的致病率差異比較大，所對應(yīng)的抗稻瘟病基因?yàn)镻i-kh、Pi-z5、Pi-zt、Pi-3、Pi-5（t）、Pi-km和Pi-ta2，致病率差異達(dá)50%以上（圖1）。

通過對各單基因系的抗譜進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，Pi-9（t）、Pi-z5和Pi-km具有較優(yōu)的抗性;Pi-t、Pi-19（t）和Pi-b抗性表現(xiàn)不佳，其中Pi-t表現(xiàn)出不具備抗性，這種情況的出現(xiàn)可能是由于這些基因并非主效抗病基因，它們控制著數(shù)量抗性或機(jī)械抗性;同基因家族的的抗病基因所表現(xiàn)出的抗性也存在差異，如Pi-km、Pi-kh、Pi-kp和Pi-ks;基因相同而供體不同的鑒別品種抗性表現(xiàn)一致，如Pi-sh和Pi-ta2，或基本一致如Pi-z5、Pi-ta和Pi-a，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于種子純度不夠或試驗(yàn)誤差，品種發(fā)病癥狀未完全表現(xiàn)而造成（表3）。

2.2 ?中國鑒別品種湖北稻瘟病菌生理小種的劃分

利用中國鑒別品種進(jìn)行湖北稻瘟病菌生理小種鑒定，195個供試菌株被劃分為ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF、ZG共7群27個生理小種（表4）。ZA菌群有01、03、07、09、11、15、47、63共8個生理小種，ZA01和ZA09出現(xiàn)頻率較高，分別為3.1%和1.5%。ZB菌群有03，09，11、13、15，17、25、31共8個生理小種，ZB15和ZB31出現(xiàn)頻率較高，分別為16.4%和2.6%。ZC菌群有07、09、11、13、15共5個生理小種，ZC15和ZC09出現(xiàn)頻率較高，分別為7.7%和4.6%。ZE菌群僅有01生理小種，出現(xiàn)頻率為40.5%。ZF和ZG菌群各有1個生理小種，出現(xiàn)頻率分別為2.6%和9.7%。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，就整個湖北而言，ZE01屬優(yōu)勢生理小種，其次為ZB15和ZG01，生產(chǎn)上應(yīng)密切關(guān)注，加以控制。

3 ?小結(jié)與討論

對湖北的195份菌株，利用30個單基因系品種進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)為0.79水平時劃分為18個致病型菌群，利用中國鑒別品種劃分為7個致病型菌群27個生理小種。Pi-9（t）和Pi-z5對湖北水稻稻瘟病菌具有較優(yōu)的抗性，可以作為抗源在生產(chǎn)上加以利用;ZE01生理小種在本區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)頻率最高，其次為ZB15和ZG01。對兩套鑒別品種的菌群劃分結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩套菌群并不存在一一對應(yīng)關(guān)系，而是相互交叉包含，如ZB菌群內(nèi)含有G07、G08、G09、G10、G12、G14和G16菌群的菌株，而G10菌群又包含有ZA、ZB、ZC、ZE和ZG菌群的菌株，由此說明稻瘟病菌群構(gòu)成非常復(fù)雜;從鑒別效率來進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)，中國品種鑒別能力有限，最多僅能劃分7個菌群，而單基因系品種由于鑒別品種數(shù)量多，劃分菌群的豐富度較高;就可操作性來看，單基因系品種數(shù)量過多，增加了試驗(yàn)工作量，可以考慮將易感病鑒別力低和基因相同而供體不同的鑒別品種適當(dāng)剔除，如Pi-t、Pi-19（t）、Pi-ta2和Pi-sh等;由于單基因系鑒別品種遺傳背景清楚，所含抗稻瘟病基因明確，因此所劃分的菌群無毒基因相對明確，鑒別結(jié)果可直接用于菌群動態(tài)監(jiān)測和指導(dǎo)生產(chǎn)，而中國鑒別品種所含抗病基因不明確，鑒別結(jié)果受到限制。

中國水稻種植區(qū)域廣闊，各地種植品種差異很大，且生境復(fù)雜多樣，僅靠一到兩套鑒別品種是有局限性的，應(yīng)根據(jù)不同的種植布局、地理環(huán)境和生態(tài)環(huán)境建立多套遺傳背景清楚、抗病基因組成合理、品種數(shù)量便于操作、適用于當(dāng)?shù)噩F(xiàn)狀的鑒別品種。同時針對不同水稻種植區(qū)域建立能代表本地菌群結(jié)構(gòu)且遺傳穩(wěn)定的的模式菌群，通過模式菌群進(jìn)行抗源篩選和品種風(fēng)險評估能大大降低生產(chǎn)成本，并且能提高試驗(yàn)可操作性和準(zhǔn)確性。

致謝：承蒙中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供IRRI單基因系品種和中國水稻所彭云良研究員在菌株分離過程中提供幫助，特此致謝！

參考文獻(xiàn)

[1] 吳雙清.關(guān)于建立湖北省稻瘟病抗性研究與利用規(guī)范的建議[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46（6）：852-853.

[2] 全國稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組.我國稻瘟病菌生理小種研究[J].植物病理學(xué)報，1980，10（2）：71-81.

[3] 吳雙清，龍家順，顏學(xué)明，等.稻瘟病持久抗源的鑒定、篩選與評價[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（1）：44-45.

[4] 劉 ?斌，張少紅，梅曼彤，等.分子標(biāo)記在水稻稻瘟病菌系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[J].植物病理學(xué)報，2003（1）：1-7.

[5] MEKWATANAKARN P， KOSITRATANA W， LEVY M， et al. Pathotype and avirulence gene diversity of Pyrucularia grisea in Thailand as determined by rice lines near-isogenie for resistance genes[J].Plant Disease，2000（84）：60-70.

[6] FLOR H H. Current status of the Gene-For-Gene concept[J]. Annual Review of Phytopathology，1971（9）：275-296.

[7] LEUG M， CORREA-VICTOREA F J， ZEIGLER R S. Genetic diversity of the rice blast fungus in a disease nursery in Colombia[J]. Phytopathology，1993，83（12）：1427-1433.

[8] 凌忠專，MEW T，王久林，等.中國水稻近等基因系的育成及其稻瘟病菌生理小種鑒別能力[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（4）：1-8.

[9] 凌忠專，雷財林，王久林.稻瘟病菌生理小種研究的回顧與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（12）：1849-1859.

[10] DB42/T208-2001.農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)抗病性鑒定操作規(guī)程[S].

（責(zé)任編輯 ?童志婷）

致謝：承蒙中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供IRRI單基因系品種和中國水稻所彭云良研究員在菌株分離過程中提供幫助，特此致謝！

參考文獻(xiàn)

[1] 吳雙清.關(guān)于建立湖北省稻瘟病抗性研究與利用規(guī)范的建議[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46（6）：852-853.

[2] 全國稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組.我國稻瘟病菌生理小種研究[J].植物病理學(xué)報，1980，10（2）：71-81.

[3] 吳雙清，龍家順，顏學(xué)明，等.稻瘟病持久抗源的鑒定、篩選與評價[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（1）：44-45.

[4] 劉 ?斌，張少紅，梅曼彤，等.分子標(biāo)記在水稻稻瘟病菌系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[J].植物病理學(xué)報，2003（1）：1-7.

[5] MEKWATANAKARN P， KOSITRATANA W， LEVY M， et al. Pathotype and avirulence gene diversity of Pyrucularia grisea in Thailand as determined by rice lines near-isogenie for resistance genes[J].Plant Disease，2000（84）：60-70.

[6] FLOR H H. Current status of the Gene-For-Gene concept[J]. Annual Review of Phytopathology，1971（9）：275-296.

[7] LEUG M， CORREA-VICTOREA F J， ZEIGLER R S. Genetic diversity of the rice blast fungus in a disease nursery in Colombia[J]. Phytopathology，1993，83（12）：1427-1433.

[8] 凌忠專，MEW T，王久林，等.中國水稻近等基因系的育成及其稻瘟病菌生理小種鑒別能力[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（4）：1-8.

[9] 凌忠專，雷財林，王久林.稻瘟病菌生理小種研究的回顧與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（12）：1849-1859.

[10] DB42/T208-2001.農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)抗病性鑒定操作規(guī)程[S].

（責(zé)任編輯 ?童志婷）

致謝：承蒙中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供IRRI單基因系品種和中國水稻所彭云良研究員在菌株分離過程中提供幫助，特此致謝！

參考文獻(xiàn)

[1] 吳雙清.關(guān)于建立湖北省稻瘟病抗性研究與利用規(guī)范的建議[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46（6）：852-853.

[2] 全國稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組.我國稻瘟病菌生理小種研究[J].植物病理學(xué)報，1980，10（2）：71-81.

[3] 吳雙清，龍家順，顏學(xué)明，等.稻瘟病持久抗源的鑒定、篩選與評價[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（1）：44-45.

[4] 劉 ?斌，張少紅，梅曼彤，等.分子標(biāo)記在水稻稻瘟病菌系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[J].植物病理學(xué)報，2003（1）：1-7.

[5] MEKWATANAKARN P， KOSITRATANA W， LEVY M， et al. Pathotype and avirulence gene diversity of Pyrucularia grisea in Thailand as determined by rice lines near-isogenie for resistance genes[J].Plant Disease，2000（84）：60-70.

[6] FLOR H H. Current status of the Gene-For-Gene concept[J]. Annual Review of Phytopathology，1971（9）：275-296.

[7] LEUG M， CORREA-VICTOREA F J， ZEIGLER R S. Genetic diversity of the rice blast fungus in a disease nursery in Colombia[J]. Phytopathology，1993，83（12）：1427-1433.

[8] 凌忠專，MEW T，王久林，等.中國水稻近等基因系的育成及其稻瘟病菌生理小種鑒別能力[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（4）：1-8.

[9] 凌忠專，雷財林，王久林.稻瘟病菌生理小種研究的回顧與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（12）：1849-1859.

[10] DB42/T208-2001.農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)抗病性鑒定操作規(guī)程[S].

（責(zé)任編輯 ?童志婷）