基于牦牛氨態(tài)氮和尿素氮分布特征構(gòu)建粗蛋白質(zhì)進食量估測模型

仲崇亮 周建偉 劉 浩 王 力 龍瑞軍*

(1.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，蘭州 730000;2.蘭州大學青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心，蘭州 730000)

尿素氮是反芻動物氮素循環(huán)的重要載體，對維系機體氮平衡具有重要意義;氨態(tài)氮是合成瘤胃微生物蛋白質(zhì)的原料，對供給宿主動物氨基酸營養(yǎng)起到關鍵性作用。迄今為止，人們已經(jīng)對反芻動物氮代謝進行了大量研究，并積累了許多有關反芻動物氨的產(chǎn)生、吸收、利用和尿素循環(huán)的資料。牦牛(Bos grunniens)作為能夠在高寒缺氧環(huán)境中生存的大型反芻家畜，其氮代謝的相關研究相對滯后。近年來，許多學者推測，在青藏高原牧草生長期短、生物量季節(jié)變化大的嚴酷自然環(huán)境下，牦牛對長期的氮源缺乏可能形成了一種特殊的適應機制［1－3］。另外，過度放牧和氣候變暖導致草場退化，進一步加劇了牦牛氮源供給的不足，使得牦牛的生產(chǎn)性能呈下降趨勢［4－5］。由此可見，對牦牛開展氮代謝的相關研究顯得尤為重要。據(jù)報道，牦牛比本地黃牛和其他低海拔反芻家畜能更有效地利用飼糧中的氮［6－9］;特別是在氮營養(yǎng)脅迫條件下，牦牛肝臟合成的尿素是飼糧可消化氮的2倍之多，并且其中87%可重新進入消化道，為瘤胃微生物提供氮源［10］。這些進一步說明，長期的環(huán)境和營養(yǎng)脅迫，牦?？赡苄纬闪烁咝У娘暭Z氮消化吸收能力和強大的體內(nèi)氮素循環(huán)利用能力，以調(diào)節(jié)體內(nèi)氮平衡和應對季節(jié)性營養(yǎng)匱乏。反芻動物體內(nèi)不同部位的尿素氮和氨態(tài)氮是觀測氮代謝的最直觀指標，而近些年來，關于飼糧氮水平對牦牛體內(nèi)不同部位氨態(tài)氮和尿素氮濃度變化特征的研究鮮有報道。本試驗主要研究在氮水平不同，能量水平一致的飼糧條件下，牦牛瘤胃液氨態(tài)氮(RNN)、瘤胃液尿素氮(RUN)、血漿尿素氮(PUN)、唾液尿素氮(SUN)濃度以及尿中尿素氮(UUN)、尿中氨態(tài)氮(UNN)日排泄量的變化，并進行相關性和回歸分析，為進一步研究牦牛氮代謝動力學過程和機制提供理論依據(jù)，并為牦牛的科學飼養(yǎng)和管理提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和日期

飼養(yǎng)試驗和樣品采集，于2013年11月至2014年1月在甘肅省天祝藏族自治縣烏鞘嶺(北緯 37°12.479'，東經(jīng) 102°51.695'，海拔 3 154 m)實驗站完成;樣品實驗室分析，于2014年3月至2014年4月在蘭州大學青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心進行。

1.2 試驗動物和飼糧

選取4頭體重［(192±12)kg］相近的3歲去勢健康公牦牛為試驗動物。試驗開始前，對牦牛作驅(qū)蟲處理，并置于代謝籠內(nèi)進行30 d的適應期，使其熟悉飼養(yǎng)條件、飼養(yǎng)人員和周圍環(huán)境。飼糧的粗料為青稞秸稈，精料為代謝能和中性洗滌纖維含量基本一致而氮水平不同的4種顆粒料，精粗比為50∶50，由此構(gòu)成4種氮水平的試驗飼糧［以粗蛋白質(zhì)水平(干物質(zhì)基礎)計，分別為6.45%、12.18%、17.81%、23.49%］，其組成及營養(yǎng)水平見表1。通過預試驗確定牦牛的干物質(zhì)采食量為 3 kg/d，約為體重的 1.5%，采食能量為 1.2倍維持需要。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 試驗設計與飼養(yǎng)管理

本試驗采用4×4拉丁方設計，分4個試驗期，每期21 d(包括15 d的預試期和6 d的正試期)。試驗牦牛于每天08:00和18:00各飼喂1次，每次干物質(zhì)飼喂量為1.5 kg(3 kg/d)。自由飲水。試驗牦牛于每個正試期的第1和2天(平均值為初重)以及第5和6天(平均值為末重)空腹稱重。

1.4 樣品采集與分析

正試期采用全收糞尿法，連續(xù)5 d收集并記錄每頭牛每天的糞尿排泄量。將每天收集的尿樣混勻，按總尿量的2%取樣，并用50%的硫酸溶液酸化，使pH＜3.0(利于固定氨態(tài)氮和抑制微生物生長)，置于－20℃下保存，用于測定UUN和UNN日排泄量。將每天收集的糞樣混勻，利用四分法按總糞量的5%取樣;然后，將每期試驗收集的5 d糞樣混勻，置于－20℃保存，用于測定糞氮。

在每個正試期第6天，晨飼前(0 h)和晨飼后2、4、6、8 h(即 08:00、10:00、12:00、14:00 和16:00)采集唾液、血液和瘤胃液。采集唾液10 mL，800×g離心15 min，取上清液分裝到 5 mL離心管，－20℃下保存，用于測定SUN濃度。血液采集采用注射器頸靜脈抽血法，每頭牛抽取10 mL血液樣品，注入15 mL離心管并加入適量乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，800×g離心15 min后，取上清液(血漿)置于若干1.5 mL離心管中，－20℃下保存，用于測定PUN濃度。用瘤胃管抽取100 mL瘤胃液后，4層紗布過濾，分裝到5 mL離心管中，并加入1～2滴飽和HgCl2溶液滅活，800×g離心15 min，取上清液置于若干1.5 mL離心管中，－20℃下保存，用于測定RUN和RNN濃度。

飼糧粗蛋白質(zhì)、有機物、粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照《飼料分析與檢測》［12］中的方法測定;糞中氮含量，采用凱氏定氮法測定［13］;UUN 日排泄量和 SUN、PUN、RUN 濃度采用二乙酰一肟法［14］測定;UNN日排泄量和RNN濃度采用Broderick等［15］的比色法測定。氮進食量根據(jù)干物質(zhì)采食量和飼糧粗蛋白質(zhì)含量計算得出;可消化氮進食量為氮進食量和糞中氮排出量之差。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行初步統(tǒng)計處理，并采用SPSS 21.0中的 Mixed Model模塊進行差異顯著性分析和多重比較;采用雙變量相關分析(Pearson)模塊進行各變量間的相關性分析，并應用回歸分析中的一元線性、多元線性和曲線回歸模塊分析和建立數(shù)學模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的變化特征

由表2和表3可知，飼糧氮水平對UUN、UNN日排泄量以及RNN、PUN、SUN濃度均有極顯著影響(P＜0.01)，且都隨著飼糧氮水平的升高而增加;對RUN濃度無顯著影響(P＞0.05)，但有隨著飼糧氮水平升高而增加的趨勢(P＜0.10)。

2.2 晨飼后不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的動態(tài)變化

由表3可知，1)晨飼后時間對RNN濃度有極顯著影響(P＜0.01);晨飼后，各組RNN濃度迅速升高，在2 h到達最高，后緩慢降低。2)晨飼后時間對SUN濃度有顯著影響(P＜0.05);采食后，各組SUN同樣呈現(xiàn)先升高后降低，但濃度高峰出現(xiàn)在4 h，且飼糧氮水平越低，變化曲線越平緩。3)晨飼后時間對PUN和RUN無顯著影響(P＞0.05)。

表2 不同飼糧氮水平下牦牛尿中尿素氮和尿中氨態(tài)氮日排泄量Table 2 Daily excretions of UUN and UNN in yaks under different dietary N levels g/d

表3 不同飼糧氮水平和晨飼后時間對牦牛瘤胃液氨態(tài)氮、血漿尿素氮、唾液尿素氮及瘤胃液尿素氮濃度的影響Table 3 Effects of different dietary N levels and time after morning feeding on concentrations of RNN，PUN，SUN and RUN in yaks mg/dL

2.3 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間相關性及相關數(shù)學模型的建立

2.3.1 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間的相關性

由表4可知，RUN濃度與RNN、PUN、SUN濃度以及UNN日排泄量之間相關性均不顯著(P＞0.05);而其他各氨態(tài)氮和尿素氮指標間均存在顯著或極顯著的正相關性，如RNN濃度與SUN濃度(r=0.971，P＜0.01)，SUN 濃度與 UUN 日排泄量(r=0.943，P＜0.01)，UUN 日排泄量與 UNN 日排泄量(r=0.902，P＜0.01)均有極顯著正相關性。

2.3.2 相關數(shù)學模型的建立

通過回歸分析 RNN、RUN、PUN、SUN濃度(mg/dL)，UUN、UNN 日排泄量(g/d)，粗蛋白質(zhì)進食量(CPI，g/d)以及可消化粗蛋白質(zhì)進食量(DCPI，g/d)等指標，可建立以下數(shù)學模型。

2.3.2.1 估測牦牛RNN和PUN濃度的模型

2.3.2.2 估測牦牛CPI的一元和多元變量模型

2.3.2.3 估測牦牛DCPI的一元和多元變量模型

表4 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間的相關性Table 4 Correlations between indexes of NH3-N and urea-N at different parts in yaks

3 討 論

3.1 不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的變化特征

一般認為，反芻家畜瘤胃微生物生長的RNN濃度耐受范圍為 6～30 mg/dL［16］，而本試驗飼喂粗蛋白質(zhì)水平為 6.45%、12.18%和 17.81%的飼糧的結(jié)果(分別為 1.02、3.06 和 5.66 mg/dL)都低于這個范圍。據(jù)韓興泰等［17］報道，飼喂粗蛋白質(zhì)水平為 8.01%和 11.76%的飼糧(代謝能分別為 9.62和9.66 MJ/kg，干物質(zhì)基礎)時，生長期牦牛 RNN濃度分別為3.3和5.9 mg/dL，也低于上述耐受范圍。相似飼糧條件下，本試驗結(jié)果低于其他反芻動物(表 5［18－25］)。另外，據(jù)韓興泰等［26］的報道，與其他反芻動物相比，牦牛瘤胃細菌具有較低的粗蛋白質(zhì)水平，使得MCP的合成效率僅為69 g/kg(每千克可消化有機物合成粗蛋白質(zhì)的量)，低于其他反芻動物的平均值169 g/kg，但對干物質(zhì)和有機物的復胃消化率并無顯著影響［17］。綜上，牦牛具有較低的RNN濃度和較低的MCP合成效率，但對干物質(zhì)和有機物的復胃消化率并沒有顯著影響，這可能與牦牛對營養(yǎng)脅迫的適應性有關。

反芻動物RUN主要來自飼糧和內(nèi)源尿素氮［29］。本試驗飼糧中沒有添加尿素，瘤胃中的尿素氮主要來自SUN和由血液經(jīng)瘤胃壁進入瘤胃的尿素氮。在本試驗中，雖然SUN和PUN濃度都隨著飼糧氮水平的提高而極顯著增加，但飼糧氮水平對RUN并沒有顯著影響，而且相對較低(表2)。這可能是因為，瘤胃中的脲酶降解尿素的能力是微生物利用氨氮能力的5倍［30］，高活性的脲酶使瘤胃液中的尿素能夠迅速降解為氨和CO2，從而使其濃度在一定程度內(nèi)不受飼糧氮水平和采食后時間的影響，而且可以保持相對較低的水平。

3.2 晨飼后不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的動態(tài)變化

本試驗中，各組牦牛在采食后，1)RNN濃度，先升高然后逐漸降低，濃度的高峰出現(xiàn)在采食后2 h，這與Kim等［31］的研究結(jié)果一致。其機理可能是，牦牛采食后，瘤胃微生物使進入瘤胃的含氮物質(zhì)和碳水化合物不斷降解［32］，但在短時間內(nèi)可降解氮相對于能量處于過剩狀態(tài)，釋放出的氨沒有被及時吸收，使采食后2 h氨態(tài)氮濃度迅速升高;隨氨態(tài)氮被瘤胃微生物利用和瘤胃壁吸收，氨態(tài)氮濃度逐漸下降。2)SUN濃度同樣呈現(xiàn)先升高后降低，但濃度高峰出現(xiàn)在采食后4 h，比RNN濃度的高峰晚2 h。這可能是由營養(yǎng)物質(zhì)在機體內(nèi)吸收利用的空間效應和時間效應引起的。3)在本試驗所設的各飼糧氮水平梯度下，PUN濃度隨著采食后時間的推移，基本保持平穩(wěn)，這可能與血液系統(tǒng)自身的穩(wěn)恒機制有關。

表5 不同反芻動物的瘤胃液氨態(tài)氮濃度Table 5 RNN concentration of different ruminants

牦牛和其他反芻動物相比(表6)，1)在低氮和中低氮水平下，牦牛的PUN濃度要高于荷斯坦小母牛和肉牛;2)各氮水平下，牦牛SUN濃度高于荷斯坦小母牛;3)在4個氮水平下(由低至高)，牦牛 SUN/PUN 為 98.14%、87.54%、94.13% 和99.31%，也高于荷斯坦小母牛。在較低的飼糧氮水平下，較高的PUN和SUN濃度反映了在長期的氮脅迫條件下牦?？赡苄纬闪烁咝У膬?nèi)源氮素循環(huán)利用能力，以維持機體的氮平衡。

3.3 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間相關性及相關數(shù)學模型的建立

一般認為，尿素在機體各部分的體液中是順濃度轉(zhuǎn)運的，最終達到一種動態(tài)平衡的狀態(tài)［33］，因此機體各部分的尿素濃度以及氨態(tài)氮濃度應該具有明顯的正相關關系。本試驗測得的RNN、PUN、SUN濃度以及UUN、UNN日排泄量間兩兩極顯著正相關也證實了這個理論。理論上講，RUN濃度與這5個指標應該也有顯著正相關性，但由于瘤胃微生物所產(chǎn)生的脲酶具有極強的活性，使得RUN濃度一直維持在較低的水平。通過一元、多元線性和曲線回歸分析各個指標，發(fā)現(xiàn)估測牦牛RNN和PUN濃度的最佳指標為SUN濃度，由其建立的線性模型(模型①)和曲線模型(模型②)擬合優(yōu)度(R2)最接近1.000。RNN和PUN濃度是反映反芻動物氮代謝最重要的2個指標，而其測定往往較困難，在生產(chǎn)實踐中可以通過測定SUN濃度，估測RNN和PUN濃度。

在放牧生產(chǎn)中，測定牦牛采食量往往費時費工，而且受許多因素的影響，使得測定放牧牦牛蛋白質(zhì)實際進食量水平有一定難度［34］。因此，有必要建立數(shù)學模型去簡捷地反映牦牛蛋白質(zhì)進食水平。在本試驗測得的各指標中，估測CPI的最佳指標是RNN和RUN濃度，而估測DCPI的最佳指標是PUN濃度和UUN日排泄量。在生產(chǎn)實踐中，可以通過測定牦牛RNN、RUN和PUN濃度以及UUN日排泄量，估測牦牛的CPI以及DCPI，從而為牦牛的放牧和管理提供參考。由于本試驗數(shù)據(jù)有限(n=16)，且是牦牛舍飼條件下得到的數(shù)據(jù)，因此數(shù)學模型有待進一步驗證和優(yōu)化。

表6 不同反芻動物的血漿尿素氮和唾液尿素氮濃度Table 6 Concentrations of PUN and SUN in different ruminants

4 結(jié)論

①RNN、PUN、SUN 濃度以及 UUN、UNN日排泄量均隨著飼糧氮水平的升高而極顯著增加;且這5個指標間兩兩極顯著正相關。

② 在本試驗測得的指標中，估測RNN和PUN濃度的最佳指標是SUN濃度，由此建立的數(shù)學模型擬合度較好。

③ RNN、RUN、PUN濃度以及UUN日排泄量與牦牛蛋白質(zhì)攝入水平密切相關，由此建立的數(shù)學模型可為估測放牧牦牛CPI及DCPI提供參考。

［1］ 董世魁，龍瑞軍，胡自治.不同采食水平下舍飼干奶牦牛能量轉(zhuǎn)化、氮、鈣、磷代謝的研究［J］.草業(yè)學報，2000，9(2):32－37.

［2］ 張瑩，郭旭生，龍瑞軍，等.飼糧氮水平對牦牛瘤胃發(fā)酵及營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝特征的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2011，23(6):1－7.

［3］ WANG H C，LONG R J，LIANG J B，et al.Comparison of nitrogen metabolism in yak(Bos grunniens)and indigenous cattle(Bos taurus)on the Qinghai-Tibetan plateau［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2011，24(6):766－773.

［4］ WANG M P，ZHAO C Z，LONG R J，et al.Rangeland governance in China:overview，inpacts on Suan county in Gansu province and future options［J］.The Rangeland Journal，2010，32:155－163.

［5］ 米見對，郭旭生，周建偉，等.日糧氮水平對牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和氮組分的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44(22):4678－4686.

［6］ LONG R J，DONG SK，CHEN X B，et al.Preliminary studies on urinary excretion of purine derivatives and creatinine in yaks［J］.The Journal of Agricultural Scinece，1999，133(6):427－431.

［7］ LONG R J，DONG S K，HU Z Z，et al.Digestibility，nutrient balance and urinary purine derivative excretion in dry yak cows fed oat hay at different levels of intake［J］.Livestock Production Science，2004，88(1/2):27－32.

［8］ LONG R J，DONG SK，WEI X H，et al.The effect of supplementary feeds on the bodyweight of yaks in cold season［J］.Livestock Production Science，2005，93(3):197－204.

［9］ WANG H C，LONG R J，ZHOU W，et al.A comparative study on urinary purine derivative excretion of yak(Bos grunniens)，cattle(Bos taurus)，and crossbred(Bos taurus×Bos grunniens)in the Qinghai-Tibetan plateau，China［J］.Journal of Animal Science，2009，87(7):2355－2362.

［10］ GUO X S，ZANG Y，ZHOU J W，et al.Nitrogen metabolism and recycling in yaks(Bos grunniens)offered a forage-concentrate diet differing in N concen-tration［J］.Animal Production Scinece，2012，52(5):287－296.

［11］ 中國飼料數(shù)據(jù)庫情報中心.中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2013年第 24版)［J］.中國飼料，2013(22):38－42.

［12］ 陳桂銀.飼料分析與檢測［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2008.

［13］ AOAC.Official methods of analysis of the association of official analytical chemists［S］.15th ed.Washington，D.C.:Association of Official Analytical Chemists，1990.

［14］ 葉應嫵，王毓.三全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.南京:東南大學出版社，1991:226－228.

［15］ BRODERICK G A，KANG JH.Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media［J］.Journal of Dairy Science，1980，63(1):64－75.

［16］ 馮仰廉.反芻動物營養(yǎng)學［M］.北京:科學版社，2004:241.

［17］ 韓興泰，陳杰，韓正康.飼喂不同蛋白水平日糧的牦牛瘤胃氮代謝與十二指腸各氮組分流量［J］.動物營養(yǎng)學報，1998，10(1):34－43.

［18］ 李靜，張曉明，莫放，等.飼料級縮二脲作為反芻動物非蛋白氮飼料的安全性與有效性系列研究(3)［J］.飼料研究，2008(1):53－56.

［19］ 王文娟.瘤胃灌注小肽對肉牛瘤胃發(fā)酵與營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的影響［D］.碩士學位論文.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2011:25－26.

［20］ 李文，黃應祥，王聰，等.戊酸對西門塔爾牛瘤胃氨態(tài)氮及尿嘌呤衍生物濃度的影響［J］.糧食與飼料工業(yè)，2006(8):42－43.

［21］ 王聰，劉強，董寬虎，等.包被銅對西門塔爾牛瘤胃pH、VFA 和氨態(tài)氮的影響［J］.新飼料，2007(11):39－40.

［22］ PRADHAM K.Rumen ecosystem in relation to cattle and buffalo nutrition［C］//Proceedings of the first A-sian Buffalo Association Congress.Khon，Kaen:［s.n.］，1994:221－243.

［23］ 陳喜斌，馮仰廉.糊化淀粉對尿素的緩釋效果的研究［J］.飼料博覽，1995(3):5－7.

［24］ 孫德成，趙智力，魏曼琳，等.不同精粗料比全混合日糧對奶牛瘤胃指標的影響［J］.飼料研究，2008(10):47－50.

［25］ 王春梅，孫龍生，趙國琦，等.日糧蛋白質(zhì)水平對湖羊胃腸道內(nèi)pH值、氨態(tài)氮和菌體蛋白的影響［J］.飼料工業(yè)，2009，30(13):27－29.

［26］ 韓興泰，胡令浩，謝敖云，等.牦牛瘤胃細菌中核糖核酸含量及其與細菌總氮比值的研究［J］.動物營養(yǎng)學報，1998，10(2):35－39.

［27］ MARINI J C，VAN AMBURGH M E.Nitrogen metabolism and recycling in Holstein heifers［J］.Journal of Animal Science，2003，81(2):545－552.

［28］ 黃潔，申躍宇，姜軍，等.日糧蛋白質(zhì)進食量對雜交育成母牛氮代謝的影響［J］.中國畜牧雜志，2012，48(11):52－54.

［29］ 劉哲，張昌吉，郝正里，等.飼喂含不同秸稈的全日糧顆粒料對綿羊瘤胃及血液代謝參數(shù)的影響［J］.中國飼料，2005(11):12－14.

［30］ 張昌吉，劉哲，郝正里，等.含不同秸稈的全飼糧顆粒料對綿羊瘤胃代謝參數(shù)的影響［J］.草業(yè)科學，2008，25(1):82－86.

［31］ KIM H D，HA J K，LTABASHI H，et al.Effects of popped soybean on concentration of ruminal peptide and blood amino acids in Holstein calves［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Science，1998，11(2):155－161.

［32］ 陳小連，賈亞紅，孫龍生，等.不同中性洗滌纖維與非纖維性碳水化合物比例日糧對山羊瘤胃和血液氮素利用的影響［J］.中國畜牧雜志，2007，43(3):36－39.

［33］ JONKER J S，KOHN R A，ERDMAN R A.Using milk urea nitrogen to predict nitrogen excretion and utilization efficiency in lactating dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，1998，81(10):2681－2692.

［34］ 王洪榮，馮宗慈，盧德勛，等.應用瘤胃液氨氮、揮發(fā)性脂肪酸和血漿尿素氮水平檢測放牧綿羊營養(yǎng)狀況的研究［J］.內(nèi)蒙古畜牧科學，1997(增刊):132－137.