Twist1、VE－cadherin 和血管生成擬態(tài)在子宮內(nèi)膜樣腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及意義

馮振中 武世伍 俞 嵐 蔡兆根 李 楠 呂秀紅 陳嘉薇

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠233030；1上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院病理科，上海200080）

子宮內(nèi)膜樣腺癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗、臨床預(yù)后不良的重要生物學(xué)原因［1］，探討腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制，能夠為臨床子宮內(nèi)膜癌的診療提供有價值的幫助。

Twist1基因是一種在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，同時具有介導(dǎo)腫瘤細胞上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的能力，在多種人類惡性腫瘤中均有高表達［2，3］。血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是新近認識的腫瘤微循環(huán)模式，即某些高侵襲性腫瘤細胞通過自身變形和細胞外基質(zhì)重塑，直接形成微循環(huán)管道，管腔無內(nèi)皮細胞襯覆，并可與宿主微血管相通［4］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，VM與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等惡性行為密切相關(guān)［5］。血管上皮鈣粘附素（VE－cadherin）是細胞黏附分子家族中的重要成員，是血管發(fā)生及血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程的重要因素，并直接參與了腫瘤VM的形成和調(diào)控［6，7］。

那么，在子宮內(nèi)膜樣腺癌中是否存在VM現(xiàn)象？Twist1、VE－cadherin的過度表達是否和 VM的發(fā)生有關(guān)？目前關(guān)于此類的研究未見報道。本研究采用免疫組化方法，結(jié)合組織芯片技術(shù)，檢測124例子宮內(nèi)膜樣腺癌、28例不典型內(nèi)膜增生和35例正常內(nèi)膜組織中Twist1、VE－cadherin和VM的表達，探討這些指標(biāo)和子宮內(nèi)膜樣腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床腫瘤預(yù)防和靶向治療提供新的思路和實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1.研究對象

子宮內(nèi)膜樣腺癌124例，來自上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院病理科，2005年1月至2009年9月手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷證實標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放療、化療，具有完整臨床資料。年齡27－81歲，平均年齡57歲。根據(jù)2000年FIGO標(biāo)準，臨床分期為101例I－II期，23例III－IV期。根據(jù)2003年WHO標(biāo)準，病理分級為高分化57例，中分化41例，低分化26例。肌層浸潤＞50%者40例，≤50%者84例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)者31例，無轉(zhuǎn)移者93例。子宮內(nèi)膜不典型增生28例（單純性不典型增生3例，復(fù)雜性不典型增生25例）；正常子宮內(nèi)膜35例（增生期16例，分泌期19例），分別取自婦科活檢和子宮平滑肌瘤的內(nèi)膜組織。

2.方法和試劑

兔抗人多克隆Twist1抗體（工作濃度1∶200，Santa Cruz公司），鼠抗人單克隆 VE－cadherin抗體（工作濃度1∶120，Abcam公司），鼠抗人單克隆CD34抗體（即用型，克隆號 QBEnd／10）、Ultra－Sensitive試劑盒和DAB顯色液購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。過碘酸Schiff（periodicacid－Schiff，PAS）染色液為蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科配制。

3.構(gòu)建組織芯片

選擇所需病例存檔蠟塊，根據(jù)HE切片仔細進行形態(tài)學(xué)觀察，確定具有代表性的病變部位并標(biāo)記，由上海芯超生物有限公司技術(shù)支持。

4.免疫組織化學(xué)染色

采用SP兩步免疫組織化學(xué)染色法，操作步驟按試劑盒說明書進行，采用已知陽性片作為對照，以PBS液代替一抗作為空白對照。Twist1和VE－cadherin蛋白檢測采用組織芯片結(jié)合免疫組化方法，VM檢測為便于觀察更多病變組織，采用常規(guī)切片結(jié)合免疫組化方法。

5.CD34和PAS雙重染色檢測VM［8］

CD34免疫組化染色，DAB顯色后，自來水沖洗1min終止顯色反應(yīng)，將切片置于0.5%高碘酸溶液中氧化5－8min，自來水沖洗2min，再用蒸餾水洗1次，于暗處置于Schiff液中染色10－20min，然后用0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗2次，每次1min，自來水沖洗2min；此后依次蘇木素淺染細胞核、鹽酸酒精分化、返藍、脫水透明以及中性樹膠封片。

6.結(jié)果判定

采用雙盲法閱片并判定結(jié)果，若腫瘤染色不均勻，則取其主要部分進行計數(shù)。Twist1蛋白主要定位于細胞核，可伴有胞質(zhì)著色；VE－cadherin陽性表達于細胞質(zhì)，呈彌漫性棕色顆粒，也可見于血管內(nèi)皮細胞連接處，呈棕褐色細線狀。判斷標(biāo)準以子宮內(nèi)膜腺上皮細胞內(nèi)出現(xiàn)定位明確、染色明顯的樣本為陽性，判定標(biāo)準［9］：①陽性細胞率：無著色為0，1－10%為1分，11－50%為2分，51－80%為3分，＞81%為4分；②染色強度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。為方便數(shù)據(jù)統(tǒng)計，兩者計分相加，＜2分為陰性，≥2分為陽性表達。

7.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析，檢驗水準取雙側(cè)α＝0.05。

結(jié) 果

1.Twist1、VE－cadherin和VM 在不同內(nèi)膜組織中的表達

在部分子宮內(nèi)膜樣腺癌中可檢測到VM結(jié)構(gòu)（16.9%，21／124），而正常子宮內(nèi)膜及不典型增生內(nèi)膜中均未觀察到VM（P＜0.01）。蘇木精－伊紅（HE）染色切片中可見由腫瘤細胞圍繞形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)可見紅細胞，通過CD34和PAS套染，表現(xiàn)為PAS陽性染色但CD34陰性的管腔樣結(jié)構(gòu)（圖1），其周圍未見壞死的腫瘤細胞。常規(guī)血管則表現(xiàn)為CD34及PAS染色均為陽性的管腔樣結(jié)構(gòu)。

Twist1、VE－cadherin在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達率分別為56.5% （70／124）、48.4%（60／124），與不典型增生和正常內(nèi)膜組織相比，有顯著差別（P＜0.01）（圖2，3）（表1）。

表1 Twist1、VE－cadherin和VM在不同內(nèi)膜組織中的表達Table 1 Expression of Twist1，VE－cadherin and VM in distinct tissue types

2.子宮內(nèi)膜樣腺癌中Twist1、VE－cadherin和VM的表達與臨床病理因素的關(guān)系

子宮內(nèi)膜樣腺癌中Twist1表達與病理分級、腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）（表2），但與患者年齡、臨床分期等指標(biāo)無明顯關(guān)系。VE－cadherin蛋白與肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.01）（表2）。腫瘤細胞分化越低，VM 形成越多，差異顯著（P＜0.01），F(xiàn)IGO臨床分期I＋II期 VM 陽性率為12.9% （13／101），III＋IV 期VM 表達率為34.8% （8／23），有明顯差異（P＜0.05）；VM組的患者更易發(fā)生肌層浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01）（表2）。

表2 Twist1、VE－cadherin和VM表達與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理因素的關(guān)系Table 2 The association of Twist1，VE－cadherin and VM with clinicopathological factors in EEC

3.子宮內(nèi)膜樣腺癌中Twist1、VE－cadherin和VM的關(guān)系

Spearman相關(guān)性分析顯示，子宮內(nèi)膜樣腺癌中Twist1和VE－cadherin的表達呈正相關(guān)（r＝0.232，P＝0.010），同時VM的形成與VE－cadherin的表達也呈正相關(guān)趨勢（r＝0.251，P＝0.005）（表3）。

表3 子宮內(nèi)膜樣腺癌中Twist1、VE－cadherin和VM的相關(guān)性Table 3 The correlation between Twist1，VE－cadherin and VM expression in EEC

討 論

Twist1是一種在進化上高度保守的螺旋－環(huán)－螺旋轉(zhuǎn)錄因子，可以促進胚層上皮轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞并具有遷徙能力，在中胚層形成過程中具有重要作用，同時Twist1也是介導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）并促進侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子。Li等［10］采用Twist1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7乳腺癌細胞株和Hela宮頸癌細胞株，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞間連接喪失，形態(tài)呈紡錘形或成纖維細胞樣，間質(zhì)細胞標(biāo)記物表達上調(diào)，上皮細胞標(biāo)記物表達下調(diào)。Hui等［11］對120例非小細胞性肺癌研究報道，Twist1在38.3%的肺癌組織中過表達，并和淋巴結(jié)累及、胸腔轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，Twist1陽性患者預(yù)后較差，干擾Twist1基因的表達，可以明顯降低肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本實驗結(jié)果與上述報道相似，在子宮內(nèi)膜組織癌變過程中，Twist1蛋白表達逐漸增高（P＜0.01），并與腫瘤細胞分化程度、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性行為相關(guān)（P＜0.05），提示Twist1基因的激活在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能通過EMT過程，促進子宮內(nèi)膜癌細胞的運動遷移能力，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞侵襲子宮肌層、累犯淋巴結(jié)等惡性生物學(xué)行為。

血管生成擬態(tài)（VM）是一種不同于傳統(tǒng)血管形成的全新腫瘤微循環(huán)模式，包括三種成分：可塑性的惡性腫瘤細胞、細胞外基質(zhì)重塑、與宿主微循環(huán)系統(tǒng)相通，特殊染色表現(xiàn)為PAS陽性而CD34陰性［12］。由于VM管道直接由腫瘤細胞圍成，與血流之間僅有一層PAS陽性的基底膜樣物相隔，無血管內(nèi)皮細胞屏障，因此更有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，在分化程度差和FIGO臨床晚期子宮內(nèi)膜癌病例中，VM結(jié)構(gòu)更明顯（P＜0.05），而腫瘤細胞形成VM后，可能進一步浸潤子宮肌層，轉(zhuǎn)移盆腔淋巴結(jié)（P＜0.05）。本實驗結(jié)果與國外有關(guān)報道基本一致：Shirakawa等［13］研究證明VM是腫瘤組織內(nèi)的一個功能性微循環(huán)，而非出血壞死形成的腔隙，血管造影證實VM腔內(nèi)有血流通過，同時在7.9%的人乳腺癌組織中存在VM現(xiàn)象，具有VM的患者更易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。Liu等［14］對96例前列腺癌患者研究顯示，24例標(biāo)本存在VM結(jié)構(gòu)，并和腫瘤Gleason分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、精囊腺侵犯、遠處轉(zhuǎn)移等明顯相關(guān)，多變量統(tǒng)計分析VM陽性患者無瘤生存率和總生存率顯著降低。

血管上皮鈣粘附素（VE－cadherin）屬于鈣依賴粘附素家族，主要表達于內(nèi)皮細胞接合黏附處，在內(nèi)皮細胞的遷移和存活、血管發(fā)生及維持血管完整性等方面中具有重要作用。相關(guān)研究報道，VE－cadherin在高侵襲性惡性黑色素瘤細胞中表達，而在低侵襲性腫瘤細胞中幾乎檢測不到，敲除VE－cadherin的表達，可以導(dǎo)致腫瘤細胞不能形成VM結(jié)構(gòu)［15］。本實驗結(jié)果顯示，64例 VE－cadherin陰性的子宮內(nèi)膜樣腺癌中，59例無VM的形成，而60例VE－cadherin高表達的標(biāo)本，有16例存在VM 結(jié)構(gòu)，二者在子宮內(nèi)膜樣腺癌中呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.251，P＝0.005）。結(jié)果說明，在子宮內(nèi)膜癌的VM形成過程中，VE－cadherin可能發(fā)揮關(guān)鍵性作用：隨著VE－cadherin表達的增加，能夠使腫瘤細胞間黏附變得松散，并促進腫瘤細胞的遷移、變形和重塑，從而誘導(dǎo)VM的形成和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

VM是腫瘤細胞可塑性的一種表現(xiàn)，本質(zhì)上表現(xiàn)為上皮細胞（內(nèi)胚層）向內(nèi)皮細胞（中胚層）的分化并獲得間充質(zhì)細胞的特性，可以推測VM的形成與EMT過程具有相似性［16］，而 VE－cadherin可能是其交叉作用位點之一。Sun和Zhao等［17，18］研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中Twist1介導(dǎo)的EMT和腫瘤遠處轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后密切相關(guān)，轉(zhuǎn)染Twist1質(zhì)粒提高了肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，也能夠促進VE－cadherin的轉(zhuǎn)錄，并誘導(dǎo)肝癌細胞VM的形成。采用熒光素酶報告基因結(jié)合ChIP分析發(fā)現(xiàn)，Twist1可以直接結(jié)合VE－cadherin基因啟動子區(qū)域并提高其轉(zhuǎn)錄活性，兩者存在直接調(diào)控的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。與上述報道相似，本研究結(jié)果顯示，Twist1的表達從正常內(nèi)膜到不典型增生和子宮內(nèi)膜癌的演變過程中不斷遞增（P＜0.01），VE－cadherin蛋白表達與 Twist1的升高趨勢一致，二者在子宮內(nèi)膜樣腺癌中呈明顯的正相關(guān)（r＝0.232，P＝0.010）。實驗結(jié)果提示，在子宮內(nèi)膜樣腺癌中，Twist1可能通過調(diào)控VE－cadherin的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞形成VM結(jié)構(gòu)，最終促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測Twist1、VE－cadherin和VM的表達情況，對于評估子宮內(nèi)膜癌的進展和預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。

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圖 版 說 明

圖1 子宮內(nèi)膜樣腺癌中VM的表達 （A×200，HE法，黑色箭頭示VM結(jié)構(gòu)；B×200，CD34和PAS雙染，黑色箭頭示PAS陽性、CD34陰性的VM結(jié)構(gòu)，紅色箭頭示PAS和CD34均陽性的血管結(jié)構(gòu)）

圖2 Twist1蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達（SP法，A×40；B×200）

圖3 VE－cadherin蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達（SP法，A×200；B×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Presence of VM in EEC（A×200，HE staining，black arrows indicated VM，B×200，CD34and PAS double staining，black arrows indicated VM with PAS positive and CD34negative staining，red arrows indicated capillary，with positive staining of CD34and PAS）

Fig.2Expression of Twist1in EEC（SP，A×40；B×200）

Fig.3Expression of VE－cadherin in EEC（SP，A×200；B×400）