IGF－1R和MMP－2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的異常表達(dá)及意義

陜 光

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科 武漢430060）

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。膀胱尿路上皮癌其生物學(xué)行為有多中心、易復(fù)發(fā)、及浸潤性生長的特點。膀胱癌的病因復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳因素，又有外在的環(huán)境因素。因此進(jìn)一步研究膀胱癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找能夠有效預(yù)測其生物學(xué)行為的指標(biāo)，對其早期診斷、指導(dǎo)治療和預(yù)后具有重要的意義。

胰島素樣生長因子－1受體（Isulin－like growth factor 1recep tor（IGF－1R）是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等多種生物活性的生長因子。研究表明其參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，與癌基因及其他細(xì)胞因子相互作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而且在基因的靶向治療中也顯示出優(yōu)越性［1－3］。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類依賴鋅離子的具有催化活性的蛋白質(zhì)，它主要通過水解細(xì)胞外周基質(zhì)成分從而保持組織中內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在癌組織中變異的蛋白水解作用導(dǎo)致腫瘤的惡化，組織的重塑，炎癥，組織侵襲和轉(zhuǎn)移［4，5］。

采用免疫組化和圖像分析方法檢測和分析了膀胱尿路上皮癌組織中IGF－1R和MMP－2蛋白的表達(dá)以及二者的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理因素的關(guān)系，有望能為膀胱尿路上皮癌的診治提供新的靶點。

材料和方法

1.材料

1.1 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2000－2006年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學(xué)證實為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3－5cm。標(biāo)本均經(jīng)HE染色，光鏡觀察診斷，按WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類（2004），浸潤性尿路上皮癌30例，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌；高級別15例，低級別5例；按 UICC臨床分期，T1 31例，T2 11例，T3－4 8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。

1.2 主要試劑

1.2.1 即用型兔抗人IGF－1R多克隆抗體；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

1.2.2 即用型兔抗人 MMP－2多克隆抗體；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

1.2.3 超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒；（北京中杉生物技術(shù)有限公司）

1.2.4 DAB顯色試盒及多聚賴氨酸 （北京中杉生物技術(shù)有限公司）

2.方法

2.1 HE染色

常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片。

2.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測IGF－1R 和MMP－2蛋白相關(guān)抗原

具體步驟：4μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法），室溫自然冷卻后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01mol／LPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時間（約3－5min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為IGF－1R和MMP－2的陽性對照組。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

2.3.1 IGF－1R 和 MMP－2以細(xì)胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

2.3.2 采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對IGF－1R和MMP－2的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

3.統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)處理 對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α為0.05。IGF－1R和 MMP－2蛋白在不同分組中的表達(dá)情況及二者在膀胱尿路上皮癌各臨床病理因素之間表達(dá)差異采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。

結(jié) 果

1.IGF－1R的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌胞膜或胞質(zhì)中可見較多棕黃色顆粒，IGF－1R呈陽性表達(dá)（圖1）；癌旁組織胞膜或胞質(zhì)中可見少量的棕黃色顆粒，IGF－1R表達(dá)弱，呈陰性表達(dá)（圖2）。圖像分析結(jié)果見表1。經(jīng)q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，IGF－1R的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織IGF－1R表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of IGF－1Rin Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織IGF－1R表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of IGF－1Rin Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

＊ 膀胱尿路上皮癌與癌旁組織比較（comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue）P＜0.05

ositive area膀胱尿路上皮癌Bladder Urothelial Cancer 50 0.3681±0.0075＊組別Group例數(shù)n平均光密度Average optical density陽性面積率Rate of p 0.3783±0.0076癌旁組織Cancer side tissue 5 0.0682±0.0032 0.0702±0.0033

2.MMP－2蛋白的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌胞膜或胞質(zhì)中可見密集分布的棕黃色顆粒，MMP－2蛋白表達(dá)強(qiáng)（圖3）；癌旁組織胞膜或胞質(zhì)中可見少量或無棕黃色顆粒，MMP－2蛋白呈弱陽性或陰性表達(dá)，（圖4）。圖像分析結(jié)果見表2。經(jīng)q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，MMP－2蛋白的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表2）。

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織MMP－2表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MMP－2 in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織MMP－2表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of MMP－2 in Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（）

＊ 膀胱尿路上皮癌與癌旁組織比較（comparison between Bladder Urothelial Cancer and cancer side tissue）P＜0.05

ositive area膀胱尿路上皮癌Bladder Urothelial Cancer組別Group例數(shù)n平均光密度Average optical density陽性面積率Rate of p 50 0.3012±0.0059 0.3112±0.0063癌旁組織Cancer side tissue 5 0.0801±0.0034 0.0789±0.0033

3.IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與膀胱癌臨床分 期的關(guān)系，結(jié)果見表3。

表3 IGF－1R、MMP－2的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床分期的關(guān)系Table 3 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of TNM stag of Bladder Urothelial Cancer

4.IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與膀胱尿路上皮 癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果見表4。

表4 IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table 4 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of LymPh nodemetastasi of Bladder Urothelial Cancer

5.IGF－1R 和 MMP－2的表達(dá)與腫瘤大小關(guān) 系，結(jié)果見表5。

表5 IGF－1R和MMP－2的表達(dá)與腫瘤大小關(guān)系Table 5 The expression of IGF－1Rand MMP－2with the correlation of tumor size and Pathologic type of Bladder Urothelial Cancer

表6 IGF－1R、MMP－2的表達(dá)與性別、年齡、病理類型等的關(guān)系Table 6 The expression of IGF－1and RMMP－2with the correlation of sex、age and Pathologic type of Bladder Urothelial Cancer

6.IGF－1R、MMP－2的表達(dá)與性別、年齡、病理 類型等的關(guān)系，結(jié)果見表6。

討 論

膀胱癌是我國泌尿外科腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均占首位，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。約2／3的膀胱癌為淺表性、易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后70%－80%不發(fā)生肌層浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較好，而20%－30%將進(jìn)展為浸潤性腫瘤；另1／3的膀胱癌較早發(fā)生肌層浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。早期診斷膀胱癌并根據(jù)其生物學(xué)特點采取及時合理的治療方法，一直是泌尿外科學(xué)者研究的重要課題。近年來，人們認(rèn)識到細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。

胰島素樣生長因子－1受體（insulin like growth factor 1recep tor，IGF－1R）系IGFs家族成員，為一種跨膜的酪氨酸蛋白受體，在神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤及肺癌中均有高表達(dá)，且通過與其配體結(jié)合對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等產(chǎn)生重要影響［6－9］?，F(xiàn)已在多種腫瘤中檢測到IGF－1R的表達(dá)。研究表明IGF－1R在多種腫瘤中的表達(dá)上調(diào)，并通過促進(jìn)細(xì)胞增埴，抑制細(xì)胞凋亡，與其他生長因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF－C）的信號通路相互作用實現(xiàn)促瘤作用，與誘導(dǎo)和保持腫瘤細(xì)胞的表型及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胰島素樣生長因子系統(tǒng)（IGFS）是一類與胰島素高度同源的多肽生長因子，近年來的研究已證實IGFS在腦癌、前列腺癌等的癌細(xì)胞中過度表達(dá)。IGFS的大多數(shù)生物學(xué)活性主要由IGF－1R來介導(dǎo)，IGF－1及其受體與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系緊密［10－14］。IGF－1可通過多種形式被調(diào)節(jié)。IGF－2 可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長，腫瘤細(xì)胞通過以自分泌和旁分泌的形式分泌IGF－2，IGF－2可以激活1型受體，調(diào)節(jié)對組織的增殖和分化作用。

MMP－2是基質(zhì)金屬蛋白酶的主要家庭成員，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與多種生理和病理過程，在細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子的作用下，參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等環(huán)節(jié)。MMP－2主要通過降解Ⅳ型膠原纖維而起作用，而Ⅳ型膠原纖維則是細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成成分。除此之外還可以降解纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖連接蛋白、多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、彈力蛋白及骨結(jié)核素等非膠原細(xì)胞外基質(zhì)。許多腫瘤細(xì)胞不僅可以自身表達(dá) MMP－2還能誘導(dǎo)臨近的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生 MMP－2［15－17］。

本研究發(fā)現(xiàn)：IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中呈高表達(dá)，提示IGF－1R和 MMP－2可能與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)；IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌的病理分級有關(guān)，表明膀胱尿路上皮癌惡性程度越高IGF－1R和MMP－2的表達(dá)水平越高；IGF－1R和 MMP－2在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌的臨床分期有關(guān)，表明膀胱尿路上皮癌分期越晚IGF－1R和 MMP－2表達(dá)水平越高。膀胱尿路上皮癌IGF－1R和 MMP－2與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，膀胱尿路上皮癌組織中IGF－1R的高表達(dá)和 MMP－2的高表達(dá)二者協(xié)同作用可能促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)。同時我們還發(fā)現(xiàn)IGF－1R和MMP－2在不同腫瘤體積大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，不同病理分級和臨床分期中的表達(dá)，都與上述變化相關(guān)，但與患者的性別、年齡及腫瘤的病理分型無關(guān)。由此可見，IGF－1R和 MMP－2與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，同時檢測這兩種蛋白的表達(dá)可以對膀胱尿路上皮癌惡性程度的判定及進(jìn)一步治療提供理論依據(jù)。

由此可見，IGF－IR和MMP－2的高表達(dá)可以促進(jìn)正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，對膀胱尿路上皮癌細(xì)胞可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。

［1］Rojas A，Liu G，Coleman I，et al.IL－6promotes prostate tumorigenesis and progression through autocrine cross－activation of IGF－IR.Oncogene，2011，30（20）：2345－2355

［2］Sichani MM，Yazdi FS，Moghaddam NA，et al.Prognos－tic value of insulin－like growth factor－I receptor expression in renal cell carcinoma.Saudi J Kidney Dis Traspl，2010，21（1）：69－74

［3］Barlaskar FM，SpaldingAC，Heaton JH，et al.Preclinical targeting ofthe type I insulin－like growth factor recep tor in adrenocortical carcinoma.J Clin Endocrinolm etab，2009，94（1）：204－212

［4］Kessenbrock K，Plaks V，Werb Z.Matrix metalloproteinases：regulators of the tumor microenvironment.Cell，2010，141（1）：52－67

［5］Qian Q，Wanq Q，Zhan P，et al.The role of matrix metalloproteinase 2on the survival of patients with nonsmall cell lung cancer：a systematic review with meta－analysis.Cancer Invest，2010，28（6）：661－669

［6］張偉，李軍，吳榮佩等.腎透明細(xì)胞癌組織IGF－I和IGF－IR的表達(dá)及其臨床意義.新醫(yī)學(xué)，2010，41（6）：371－378

［7］Sichani MM，Yazdi FS，Moghaddam NA，et al.Prognostic value of insulin－like growth factor－I receptor expression in renal cell carcinoma.Saudi J Kidney Dis Traspl，2010，21（1）：69－74

［8］He Z，Cen D，Luo X，et al.Downregulation of miR－383 promotes glioma cell invasion by targeting insulin－like growth factor 1receptor.Med Oncol，2013，30（2）：557

［9］Lin F，Shen Z，Xu X，et al.Evaluation of the expression and role of IGF pathway biomarkers in human sarcomas.Int J Immunopathol Pharmacol，2013，26（1）：169－177

［10］Shen K，Liang Q，Xu K，et al.MiR－139inhibits invasion and metastasis of colorectal cancer by targeting the type I insulin－like growth factor receptor.Biochem Pharmacol，2012，84（3）：320－330

［11］Oh SH，Kang JH，Kyu Woo J，et al.A multiplicity of anti－invasive effects of farnesyl transferase inhibitor SCH66336in human head and neck cancer.Int J Cancer，2012，131（3）：537－547

［12］Wang YH，Han XD，Qiu Y，et al.Increased expression of insulin－like growth factor－1receptor is correlated with tumor metastasis and prognosis in patients with osteosarcoma.J Surg Oncol，2012，105（3）：235－243

［13］He X，Wang J，Messing EM，et al.Regulation of receptor for activated C kinase 1protein by the von Hippel－Lindau tumor suppressor in IGF－I－induced renal carcinoma cell invasiveness.Oncogene，2011，30（5）：535－547

［14］Brouxhon SM，Kyrkanides S，Teng X，et al.Soluble E－cadherin：a critical oncogene modulating receptor tyrosine kinases，MAPK and PI3K／Akt／mTOR signaling.Oncogene，2014，33（2）：225－235

［15］Stewart CJ，Crook ML.CD147（EMMPRIN）and matrix metalloproteinase－2expression in uterine endometrioid adenocarcinoma.Pathol Res Pract，2011，207（1）：30－36

［16］張軒，何俏軍，褚永權(quán)等.胃癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶－2和胰島素樣生長因子－1蛋白表達(dá)及其意義.中華外科雜志，2010，48（10）：774－779

［17］Shou ZX，He QJ，Chu YQ，et al.Expression of matrix metalloproteinase－2and insulin－like growth factor－1 in gastric carcinoma and their clinicopathological significance.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2010，48（10）：774－779

圖 版 說 明

圖1 IGF－1R的表達(dá) 膀胱尿路上皮癌胞膜內(nèi)可見較多棕黃色顆粒（→），IGF－1R表達(dá)強(qiáng)（S－P×200）。

圖2 IGF－1R的表達(dá) 癌旁組織胞質(zhì)內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒（→），IGF－1R表達(dá)弱（S－P×200）。

圖3 MMP－2蛋白的表達(dá)膀胱尿路上皮癌胞核和胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，MMP－2蛋白表達(dá)強(qiáng)（S－P×200）。

圖4 MMP－2的表達(dá) 癌旁組織胞核和胞漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，MMP－2表達(dá)弱（S－P×200）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1IGF－1Rexpression in Bladder Urothelial Cancer There were plenty of brown particles in the cell membrane，which showed IGF－1Rexpressed strongly.S－P×200

Fig.2IGF－1Rexpression in cancer side tissue.There were few brown particles in the cell membrane，which showed IGF－1Rexpressed weakly.S－P×200

Fig.3MMP－2expression in Bladder Urothelial Cancer .There were plenty of brown particles in the nuclear or cytoplasmic，which showed MMP－2expressed strongly.S－P×200

Fig.4MMP－2expression in cancer side tissue.There were few brown particles in the nuclear or cytoplasmic，which showed MMP－2expressed weakly.S－P×200