絞股藍(lán)總皂苷對(duì)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響*

王繼慧，張小卿，馬月丹，張 燚，馬賢德，吳景東

1)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 沈陽(yáng)110847 2)河南財(cái)政稅務(wù)高等?？茖W(xué)校對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易系 鄭州451464 3)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 沈陽(yáng)110847 4)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院 沈陽(yáng)110847 5)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院遼寧省肛腸醫(yī)院皮膚科 沈陽(yáng)110003 6)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 沈陽(yáng)110847 7)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)生工作處 沈陽(yáng)110847

#通訊作者，男，1962年10月生，博士，教授，研究方向:中醫(yī)美容、皮膚衰老與中藥抗皮膚衰老研究，E-mail:lnzywjd0719@163.com

人皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層關(guān)鍵組成部分，可合成皮膚膠原蛋白。Leccia 等［1］首次發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)波紫外線(ultraviolet A，UVA)有誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的作用。嚴(yán)重的UVA 照射后，人體細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡均增加［2］。UVA 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持和DNA 損傷細(xì)胞清除的重要調(diào)節(jié)機(jī)制［3］。絞股藍(lán)味甘、微苦、性寒，歸脾、肺、腎三經(jīng)，因可培補(bǔ)儲(chǔ)藏尤具調(diào)補(bǔ)脾肺之功，在抗皮膚老化中受到一貫的重視和應(yīng)用［4-7］。絞股藍(lán)總皂苷(gypenosides，Gyp)為絞股藍(lán)主要藥理成分。作者通過觀測(cè)大鼠Gyp 含藥血清對(duì)UVA 誘導(dǎo)的光老化人皮膚成纖維細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，探討Gyp 調(diào)控細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 人永生化皮膚成纖維細(xì)胞株HSF 購(gòu)于上海艾研生物科技有限公司。Gyp(MUST-11031401)購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，用生理鹽水配制成相應(yīng)劑量備用。兔抗人Bax、Bcl-2 抗體、內(nèi)參β-actin 抗體及HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，批號(hào)KGA7071。Trizol 由Invitrogen公司提供。Bax、Bcl-2 及內(nèi)參GAPDH 引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限公司合成，引物序列如下。Bax 上游引物序列 5'-AAGCTGAGCGAGTGTCT CAAG-3'，下游引物序列 5'-CAAAGTAGAAAA GGGCGACAAC-3'，產(chǎn)物大小178 bp。Bcl-2 上游引物序列5'-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3'，下游引物序列5'-AGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，產(chǎn)物大小180 bp。內(nèi)參GAPDH 上游引物序列5'-GT CAGTGGTGGACCTGACCT-3'，下游引物序列5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3'，產(chǎn)物大小420 bp。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 PCR 儀、電泳儀為北京六一儀器設(shè)備廠產(chǎn)品。ChemiImager5500 型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alphainnotech Chemi Imager 公司。UVA光源(20 W)購(gòu)自南京華強(qiáng)電子有限公司。

1.3 Gyp 含藥血清的制備 健康雄性SPF 級(jí)SD大鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(遼)2008-0005。用隨機(jī)數(shù)字表法將20只大鼠(體重200～250 g)分為空白血清組和低、中、高劑量含藥血清組4組，每組5 只。依據(jù)Meeh-Rubner 公式計(jì)算，低劑量含藥血清組大鼠Gyp 灌胃劑量80 mg/d，設(shè)定中高劑量組給藥量分別是低劑量組的2、4 倍，1 次/d，共灌胃7 d?？瞻籽褰M灌胃生理鹽水。第7 天灌胃結(jié)束1 h 后，經(jīng)主動(dòng)脈取血保存于促凝管內(nèi)，室溫靜置1 h，2 000 r/min 離心10 min，收集上清。每組大鼠血清于同一離心管(50 mL)中混合，56℃水浴滅活，過濾滅菌，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 光老化皮膚成纖維細(xì)胞模型的制備 參照陶冶等［8］建立光老化皮膚成纖維細(xì)胞模型。HSF 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗DMEM 培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日用2.5 g/L 胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用2.5 g/L 胰酶消化后加入新鮮培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以1×104mL－1接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去舊培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次至無色，加入2 000 μL PBS，置于UVA 下照射。根據(jù)文獻(xiàn)［9］計(jì)算照射劑量，照射劑量=照射強(qiáng)度×照射時(shí)間。照射強(qiáng)度采用紫外線輻照計(jì)測(cè)量。最終照射劑量為36 J/cm2。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將模型細(xì)胞隨機(jī)分為5組，每組6瓶，分別為模型組、正常血清組和低、中、高劑量Gyp組。細(xì)胞經(jīng)照射后，棄去PBS，模型組加入5 mL 新鮮培養(yǎng)液，正常血清組加入5 mL 含體積分?jǐn)?shù)10%正常大鼠血清的新鮮培養(yǎng)液，低、中、高劑量Gyp組分別加入5 mL 含體積分?jǐn)?shù)10%低、中、高劑量大鼠含藥血清的新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h 后，取細(xì)胞用于相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。以未照射的HSF 作為空白對(duì)照。

1.6 細(xì)胞凋亡的TUNEL 法檢測(cè) 細(xì)胞用PBS 漂洗2 次，周圍用吸水紙吸干，按TUNEL 法檢測(cè)試劑盒說明操作，用FITC 標(biāo)記細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每張爬片選取5 個(gè)染色良好視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞，取5 個(gè)視野的均數(shù)為凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.7 細(xì)胞中Bax 與Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用RT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中Bax 與Bcl-2 mRNA，PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像，以目的基因與內(nèi)參基因條帶積分光密度值的比值表示目的基因mRNA 的表達(dá)水平。采用Western blot 法檢測(cè)Bax、Bcl-2 蛋白，兔抗人Bcl-2 和Bax一抗稀釋50 倍，HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋200倍，ECL 發(fā)光試劑盒顯像，用圖像分析系統(tǒng)分析，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 處理數(shù)據(jù)，組間凋亡細(xì)胞數(shù)、相應(yīng)基因mRNA 和蛋白表達(dá)水平的比較用采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 6組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 見表1。

表1 6組凋亡細(xì)胞數(shù)的比較

2.2 6組細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA 表達(dá)的比較見圖1、表2。

圖1 RT-PCR 法檢測(cè)6組細(xì)胞中Bax(上圖)和Bcl-2(下圖)mRNA 的表達(dá)

表2 6組細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA 表達(dá)的比較

2.3 6組細(xì)胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的比較 見圖2、表3。

圖2 Western-blot 法檢測(cè)6組細(xì)胞中Bcl-2(上圖)和Bax(下圖)蛋白的表達(dá)

表3 6組細(xì)胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的比較

3 討論

研究［2-3］認(rèn)為，UVA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一個(gè)綜合性生化反應(yīng)過程。研究［10］發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 基因家族與細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)，其在線粒體通路中具有放大死亡受體通路信號(hào)的作用;Bcl-2 高表達(dá)可抑制凋亡，而促凋亡蛋白Bax 等可使線粒體膜通透性增加，引發(fā)細(xì)胞凋亡線粒體途徑開啟。生理狀態(tài)下Bcl-2 和Bax 形成動(dòng)態(tài)平衡。UVA 輻射可使細(xì)胞色素C 在凋亡早期從線粒體中釋放進(jìn)入胞質(zhì)，進(jìn)而下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，并上調(diào)Bax 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［11-12］。

該研究中，作者觀察到，UVA 模型組細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)降低，而Bax mRNA 和蛋白表達(dá)明顯升高，說明UVA 照射激活了人成纖維細(xì)胞HSF 的凋亡通路;而Gyp 含藥血清干預(yù)后，經(jīng)UVA 照射的HSF 細(xì)胞凋亡較未干預(yù)細(xì)胞明顯減弱，Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)升高，而Bax mRNA 和蛋白表達(dá)明顯降低，且高劑量Gyp組效果更顯著。該研究結(jié)果說明Gyp 可通過上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2、下調(diào)凋亡促進(jìn)基因Bax 的表達(dá)，緩解二者之間的失衡狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡線粒體通路的活化，最終減少了光老化細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，Gyp 可以逆轉(zhuǎn)UVA 誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞的凋亡;其作用機(jī)制可能是上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 和下調(diào)促凋亡基因Bax 的表達(dá)，緩解Bcl-2和Bax 表達(dá)之間的失衡狀態(tài)，從而抑制了凋亡線粒體信號(hào)通路活性。

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