毛細(xì)管電泳法測定綠茶酶解液中的還原糖成分

王芝彪，章銀軍，龔玉雷，沈雪亮

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州，310014)

茶飲料是一種非酒精飲料，生產(chǎn)中一般選用粗茶作為原料加水浸提，存在提取率低、滋味淡、茶沉淀多等缺點，現(xiàn)代生物酶技術(shù)的應(yīng)用可解決這些缺點。添加外源果膠酶、纖維素酶等［1］主要植物破壁酶，將高聚植物纖維、果膠等細(xì)胞壁成分水解成可溶性還原糖，既能促進(jìn)茶葉中有效成分的擴(kuò)散和浸出，又能增加茶浸提液的甜度。

在綠茶的浸提中通常把果膠酶和纖維素酶等酶復(fù)配起來應(yīng)用，這些復(fù)配的水解酶水解綠茶后主要產(chǎn)物是不同的還原糖，其中果膠酶水解的終產(chǎn)物主要是半乳糖醛酸、鼠李糖［2-3］等;纖維素酶水解后的終產(chǎn)物主要是葡萄糖［4］等;糖苷酶水解的終產(chǎn)物主要是半乳糖和甘露糖等［5］，所以準(zhǔn)確地檢測綠茶酶解液中還原糖的組分和含量，可以為評價每種酶水解綠茶的效果和植物破壁酶的復(fù)配提供參考。

根據(jù)茶葉來源和葉芽的不同，綠茶中的還原糖組分和含量也不同。結(jié)合文獻(xiàn)報道［6-7］，綠茶中主要含有麥芽糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖醛酸等9種還原糖。目前，還原糖定量分析方法主要有氣相色譜(GC)或高效液相色譜(HPLC)［6］。由于還原糖具有沸點高、不易揮發(fā)且不含生色基團(tuán)等特點，使用氣相檢測需要將還原糖轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物，操作繁瑣復(fù)雜。液相檢測需要添加特殊設(shè)備如蒸發(fā)光檢測器［7］或衍生發(fā)色基團(tuán)［8］等，檢測的靈敏度相對較低，所用的液相柱價格昂貴。毛細(xì)管電泳法是根據(jù)質(zhì)荷比分離物質(zhì)，具有操作簡單、分離效率高、樣品消耗少、綠色環(huán)保等特點，能彌補(bǔ)氣相和液相色譜的不足。利用毛細(xì)管電泳儀檢測還原糖目前僅見于牛奶、啤酒［11］、海帶中單糖［9］和藏紅花［10］等，在綠茶酶解液還原糖的檢測中尚未見報道。本文對毛細(xì)管電泳法的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了測定綠茶浸提液中還原糖組分和含量的實驗方法，并進(jìn)一步驗證了該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 原材料

炒青綠茶:由杭州浙大百川生物食品技術(shù)有限公司(以下簡稱浙大百川)提供。

自制復(fù)合水解酶:將果膠酶和纖維素酶(由浙大百川提供)按比例復(fù)配而成［14］，其中果膠酶和纖維素酶的活力分別為527．96 U/mL和167．3 IU/mL。

植物水解酶:購自諾維信公司，其中果膠酶活力為437．0 U/mL，纖維素酶活力為8．3 IU/mL。

1.2 儀器與試劑

Beckman P/ACETM MDQ CE型毛細(xì)管電泳儀，非涂層石英毛細(xì)管柱(50 μm×61．5 cm，有效長度54．5 cm)。

色譜級甲醇和分析級藥品:PMP(1-甲基-3-苯基-5-吡唑啉酮)，NaOH，HCl，檸檬酸，檸檬酸三鈉，三氯甲烷和標(biāo)準(zhǔn)品 D-麥芽糖(Mal)、D-乳糖(Lac)、D-木糖(Xyl)、L-阿拉伯糖(Ara)、D-葡萄糖(Glc)、D-鼠李糖(Rha)、D-半乳糖(Gal)、D-甘露糖(Man)、D-半乳糖醛酸(GalA)。

1.3 電泳標(biāo)準(zhǔn)品的衍生

準(zhǔn)確配制濃度均為10 mmol/L的9種還原糖混合標(biāo)樣，取200 μL標(biāo)樣(或綠茶浸提液)加入400 μL 0．3 mol/L 的 NaOH和400 μL 0．5 mol/L的PMP(1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮，配好放至深黑色)衍生劑混勻，70℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后加入400 μL 0．3 mol/L的HCl溶液和1 mL CHCl3萃取，去掉下層液，重復(fù)萃取3 次［11］，12 000 r/min 離心 6 min，取上清液備用進(jìn)樣。

1.4 綠茶樣品的制備

1．0 g烘干的炒青綠茶浸泡于20 mL pH 5．0的檸檬酸緩沖液中，加入不同的水解酶，在50℃、200 r/min下保溫8 h，將酶解液于12 000 r/min下離心6 min，取上清液，按照1．2衍生標(biāo)樣的方法將綠茶樣品衍生后備用進(jìn)樣。

1.5 毛細(xì)管電泳測定方法

測定條件:結(jié)合文獻(xiàn)報道［10-11］確定電壓20 kV，硼酸濃度175 mmol/L，pH 值10．5，柱溫25℃，每次使用前用0．1 mol/L NaOH和超純水各洗5 min。

進(jìn)樣程序:0．1 mol/L NaOH溶液洗柱3 min，超純水洗柱5 min，緩沖液洗柱7 min，0．5 psi進(jìn)樣10 s，檢測波長254 nm，20 kV電壓分離60 min。

1.6 分析計算方法

分離度又稱分辨率，是判斷分離物質(zhì)在色譜柱中的分離情況，用R表示，R等于相鄰色譜峰保留時間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。

樣品加標(biāo)回收率:取2份相同的樣品，其中1份加入定量的待測成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);2份同時按相同的步驟分析，加標(biāo)的1份所得的結(jié)果減去未加標(biāo)1份所得的結(jié)果，其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的理論值之比即為樣品加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率的測定，是實驗室內(nèi)經(jīng)常用以自控的一種質(zhì)量控制技術(shù)。

最低檢測極限由于缺少明確的定義，目前比較公認(rèn)的分為方法檢測限和儀器檢測限兩種，本文使用方法檢測極限。公式如下:

式中:T1、T2指色譜峰的保留時間;Y1、Y2色譜峰峰寬;Ct測得樣品的總量;Cb本底的量;Cstd標(biāo)樣添加量;Cl樣品的最低檢測極限;Ki置信因子取3;Si為12次樣品讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差;C樣品含量;樣品測量讀數(shù)平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化

2．1．1 采用毛細(xì)管電泳測定9種還原糖標(biāo)樣

毛細(xì)管電泳條件:電壓 20 kV，硼酸濃度 175 mmol/L，pH 值 10．5，柱溫 25 ℃，每次使用前用 0．1 mol/L NaOH和超純水各洗5 min，9種糖在該條件下有較好的分離(圖1)。但是乳糖和木糖、半乳糖和甘露糖這兩對糖的出峰時間比較接近，分離度分別是0．77和0．91，均小于1，不能達(dá)到基線分離。另外最后一個峰(半乳糖醛酸)的出峰時間相對較長，達(dá)到了44．39 min，為了提高實驗的分離效率，本文用該峰的出峰時間代替整體峰的出峰時間，把乳糖和木糖的分離度R1、半乳糖和甘露糖的分離度R2，以及半乳糖醛酸的出峰時間TGalA(min)，作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對毛細(xì)管電泳分離影響較大的硼酸緩沖液濃度、pH值和電壓條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得9種還原糖的基線分離。

圖1 毛細(xì)管電泳初始條件下分離9種標(biāo)樣圖Fig．1 Separation of 9 standard samples by capillary electrophoresis under initial conditions

2．1．2 pH 值的影響

pH值對物質(zhì)的電泳分離條件影響非常大，糖類樣品通常在pH 9～11之間能夠得到較好的分離。所以本實驗先固定硼酸濃度為175 mmol/L，分離電壓20 kV，調(diào)節(jié) pH 至 10．5～11．2。實驗結(jié)果表明(表1)，隨著pH值的增大，乳糖和木糖的分離度(R1)有較大的提高，半乳糖和甘露糖的分離度(R2)也緩慢增大，同時半乳糖醛酸的出峰時間TGalA向后推移。從出峰時間和分離度兩方面考慮，選擇pH值為11．0進(jìn)行下一步實驗。

表1 pH值對R1、R2和半乳糖醛酸出峰時間的影響Table 1 Effects of pH value on the separation of R1，R2and migration time of galacturonic acid

2．1．3 硼酸濃度的影響

硼酸與糖結(jié)構(gòu)中的羥基形成絡(luò)離子，影響電滲流以及遷移率，是分離糖類物質(zhì)常用的緩沖液。固定pH值為11．0，分離電壓20 kV，調(diào)節(jié)硼酸濃度為150～225 mmol/L。表2顯示了不同硼酸濃度緩沖液對分離度的影響，分離度R1隨著硼酸濃度的增大而增大，R2先增加后減小，但出峰時間也在隨著硼砂濃度的增大而延長，因此，選擇硼酸濃度為200 mmol/L作進(jìn)一步實驗。

表2 硼酸濃度對R1、R2和半乳糖醛酸出峰時間的影響Table 2 Effects of borate concentrations on the separation of R1，R2and migration time of galacturonic acid

2．1．4 電壓值的影響

固定pH為11．0，硼砂濃度為200 mol/L，微調(diào)電壓20～21．5 kV。表3 顯示，R1的值大于1．0，基本達(dá)到了色譜基線分離條件，但隨著R1的增大導(dǎo)致木糖向乳糖峰靠近。R2隨著電壓值增大而先增加后降低，降低原因是兩峰峰寬變大，所以電壓值確定為21 kV，在該值下出峰時間較短，各組還原糖都得到了基線分離。

表3 電壓對R1、R2和半乳糖醛酸出峰時間的影響Table 3 Effects of voltage on the separation of R1，R2 and migration time of galacturonic acid

2．1．5 應(yīng)用優(yōu)化條件測定9種還原糖標(biāo)樣

經(jīng)上述實驗優(yōu)化后的毛細(xì)管電泳最佳測定條件為電壓 21 kV，硼酸緩沖液濃度 200 mmol/L，pH 11．0，柱溫25 ℃，進(jìn)樣程序，0．1 mol/L NaOH 溶液洗柱3 min，超純水 5 min，緩沖液 7 min，0．5 psi進(jìn)樣 10 s，檢測波長254 nm，21 kV電壓分離60 min。在此條件下，9種還原糖中乳糖和木糖、半乳糖和甘露糖這兩對糖的分離度分別是1．23和1．32。如圖2所示，9種還原糖獲得了很好的分離，達(dá)到了基線完全分開的色譜分析要求。

圖2 9種混合還原糖標(biāo)樣電泳圖Fig．2 Typical electropherograms of nine standard reducing carbohydrates

2.2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和最低檢測極限

將9種還原糖混合標(biāo)樣的母液，稀釋至0．5、1、2、4、8、10 mmol/L六個濃度梯度，分別衍生后進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)作圖，得9種還原糖的回歸方程，見表4。線性回歸方程相關(guān)系數(shù) r2在 0．9939～0．9994 之間均大于 0．99，線性相關(guān)性較好。再把9種還原糖母液稀釋到8 mmol/L，衍生后重復(fù)進(jìn)樣12次，按信噪比(S/N=3)算出最低檢測極限(Cl)。表4顯示，最低檢測極限在0．09～0．23 μmol/mL，表明該方法的檢測靈敏度較高。

2.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

取9種標(biāo)樣還原糖混合液衍生，1天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次;另取1份放在4℃的冰箱中，每天進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣5天，記錄出峰時間和峰面積，結(jié)果見表5。日內(nèi)和日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1．2～4．1和1．3～2．8、1．4～4．7 和 1．5～5．0之間，表明儀器日內(nèi)重復(fù)性良好，5天內(nèi)的穩(wěn)定性也能達(dá)到檢測要求，可以滿足大批量的實驗結(jié)果處理分析。

2.4 加標(biāo)回收率試驗

精確稱取1 g茶葉樣品3份，添加8 U的自制復(fù)合水解酶和4 U的纖維素酶，水解后的酶解液作為本底還原糖的量，再分別按表6加入5種標(biāo)樣還原糖，按1．4方法處理，各重復(fù)3次取平均值，按公式計算出每個濃度的還原糖加標(biāo)回收率。5種還原糖的加標(biāo)回收率在96．74%～100．38%之間，符合復(fù)雜物質(zhì)回收率可以在95%～110%之間的要求，說明該方法能很好地應(yīng)用于檢測綠茶酶解液中還原糖的組分和含量。

表4 9種還原糖的出峰時間、線限方程、相關(guān)系數(shù)和最低檢測限Table 4 Retention time of 9 reducing carbohydrates，regression analysis，Co-efficient and minimum detection limit of CZE method

表5 日內(nèi)重復(fù)性及日間穩(wěn)定性實驗Table 5 Precision of the migration time and corrected peak area of the tested carbohydrates by the developed CZE method

2.5 采用CZE檢測綠茶酶解液中還原糖的組分與含量

2．5．1 CZE測定2種酶解液中還原糖的組分圖

加入自制復(fù)合水解酶和諾維信植物水解酶按果膠酶活力計各8 U，按1．4的方法處理后進(jìn)樣，測定綠茶酶解液中還原糖的組分和含量。如圖3和圖4所示，兩種酶水解綠茶后酶解液中還原糖的組分主要有木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸5種，5種還原糖與標(biāo)樣的出峰時間能很好地吻合，并且不同峰相互之間的出峰時間間隔也很大。所以該優(yōu)化條件能夠完全滿足檢測綠茶酶解液中還原糖的需要。

表6 毛細(xì)管電泳檢測綠茶酶解液中加標(biāo)回收率Table 6 CZE determination of the reducing sugars in the sample of green tea extract and recovery analysis

圖3 諾維信植物水解酶水解綠茶后酶解液中主要還原糖的成分圖Fig．3 The compositional reducing carbohydrates of plant hydrolysis enzyme hydrolysis of green tea extract

圖4 自制復(fù)合水解酶水解綠茶后酶解液中主要還原糖的成分圖Fig．4 The compositional reducing carbohydrates ofcompound enzyme enzyme hydrolysis of green tea extract

2．5．2 采用CZE測定2種酶解液中還原糖的含量

精確稱取1g茶葉3份，1份加入水作為對照組，另外2份分別加入諾維信植物水解酶和自制復(fù)合水解酶各8 U，按1．4的方法處理后進(jìn)樣，重復(fù)3次，測定綠茶酶解液中還原糖的組分和含量，結(jié)果見表7。對照組只加水不加酶，只有少量葡萄糖，添加植物水解酶和自制復(fù)合水解酶組，5種還原糖量與對照組相比成倍的增加，特別是葡萄糖和半乳糖醛酸分別提高了十幾倍。兩種水解酶水解綠茶后產(chǎn)生的5種還原糖含量基本相近，沒有太大的差異。所以本實驗室自制復(fù)合水解酶在水解綠茶產(chǎn)生還原糖含量的參比指標(biāo)上，可以和諾維信植物水解酶相媲美。

本實驗可以再結(jié)合其他評價指標(biāo)如綠茶浸提率、茶湯顏色等，系統(tǒng)而全面地評價自制復(fù)合水解酶對綠茶的水解效果，從而得出一種對綠茶濃縮液生產(chǎn)效果好且物美價廉的自制復(fù)合水解酶。

3 結(jié)論

本文針對綠茶酶解液中還原糖的檢測建立了一種快速、高效、靈敏度高的毛細(xì)管電泳方法，其檢測條件為:電壓 21 kV，硼酸緩沖液200 mmol/L，pH 11．0，柱溫25℃，進(jìn)樣程序，0．1 mol/L NaOH溶液洗柱3 min，超純水 5 min，緩沖液 7 min，0．5 psi進(jìn)樣 10s，檢測波長254 nm，21 kV電壓分離60 min。

對此方法進(jìn)行可行性試驗顯示，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0．9939～0．9994 之間均大于 0．99，達(dá)到了檢測物質(zhì)的線性要求。檢測極限在0．09～0．23 μmol/mL，方法的檢測的靈敏度高。日內(nèi)和日間的重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1．2～4．1和1．3～2．8、1．4～4．7 和1．5～5．0，表明儀器日內(nèi)重復(fù)性良好，5天內(nèi)的穩(wěn)定性也能達(dá)到檢測要求，并且5種還原糖的加標(biāo)回收率在96．74%～100．38%，完全符合檢測分析方法所需要的數(shù)據(jù)條件。應(yīng)用本方法檢測諾維信植物水解酶和實驗室自制復(fù)合水解酶水解綠茶后產(chǎn)生還原糖的組分和含量，得出兩種酶解液中還原糖的組分相同，含量相近，自制復(fù)合水解酶在水解綠茶產(chǎn)生還原糖指標(biāo)上，復(fù)配效果非常好。

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