解聚素—金屬蛋白酶17和上皮生長因子受體在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

2014-12-15 17:04沈照立等

中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2014年31期

沈照立等

[摘要] 目的探討解聚素-金屬蛋白酶17（ADAM17）和上皮生長因子受體（EGFR）在人腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)及臨床意義。方法回顧性分析同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2011年1月～2013年11月收治的并行外科手術(shù)治療的人腦膠質(zhì)瘤患者38例，選擇同期在我院行外科手術(shù)治療腦外傷患者15例為對照組。采用免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測膠質(zhì)瘤組織中ADAM17和EGFR蛋白的表達(dá)，并分析其與人腦膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。結(jié)果人腦膠質(zhì)瘤中ADAM17和EGFR表達(dá)較對照組明顯增多（P < 0.05），且隨著惡性程度的提高，表達(dá)逐漸增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論 ADAM17和EGFR在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，且隨著腫瘤惡性程度的增高而增加，提示ADAM17和EGFR在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中可能起重要的作用，其水平高低與膠質(zhì)瘤的惡性程度具有一定相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)瘤；解聚素-金屬蛋白酶17；表皮生長因子受體

[中圖分類號] R730 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（a）-0027-04

Expression of ADAM17 and EGFR in human brain glioma and its clinical significance

SHEN Zhaoli XUE Fei SHEN Rui CHEN Xianzhen

Department of Neurosurgery， the 10th People's Hospital Affiliated to Tongji University， Shanghai 200072， China

[Abstract] Objective To explore the expression of ADAM17 and EGFR in human brain gliomas and its clinical signifcance. Methods 38 patients with human brain glioma treated for surgical operation in the 10th People's Hospital Affiliated to Tongji University （"our hospital" for short） from January 2011 to November 2013 were analyzed retrospectively. 15 patients with cerebral trauma treated for surgical operation in our hospital were selected as the control group. SP immunohistochemical method and Western blot were used to examine the expression of ADAM17， EGFR， and the relationship between the expression of ADAM17， EGFR and pathological grading in human brain glioma was analyzed. Results ADAM17 and EGFR expression in human brain glioma were significantly higher than those in the normal controls （P < 0.05）. The expression levels of ADAM17 and EGFR proteins increased with the increased grade of malignancy， and difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion ADAM17 and EGFR are expressed in the human brain glioma. The levels of ADAM17 and EGFR in human brain glioma increased with the rise of tumor grade. The results indicate that ADAM17 and EGFR may play important roles in the occurrence of human brain gliomas， and be related to the malignancy of glioma.

[Key words] Glioma； ADAM17； EGFR

人腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，死亡率較高，其發(fā)病原因尚不完全清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子及基因參與了其發(fā)病過程[1]。解聚素-金屬蛋白酶17（adisintegrin and metalloproteinase17，ADAM17）是金屬蛋白酶解聚素家族成員之一，又稱為腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)換酶。大量研究資料顯示，ADAM17在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤的浸潤程度、轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)[2]。上皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor，EGFR）是一種膜受體，具有酪氨酸蛋白激酶活性，與生長因子構(gòu)成信號通路，被激活后可以傳遞細(xì)胞信號。許多研究已發(fā)現(xiàn)，EGFR在多種惡性腫瘤中活性增高，并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[3]?？v觀大量關(guān)于ADAM17和EGFR的研究，隨著人們對其基礎(chǔ)及臨床研究的不斷深入，其臨床應(yīng)用越來越廣泛，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)較高，但與腦膠質(zhì)瘤關(guān)系的相關(guān)研究并不多。鑒于其在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)的情況，可將其作為許多腫瘤的診斷標(biāo)志物并判斷腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后情況。本研究通過觀察ADAM17和EGFR在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)特點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2011年1月～2013年11月收治的并行外科手術(shù)治療的人腦膠質(zhì)瘤患者38例，其中，女20例，男18例，年齡11～85歲，平均（44.26±7.19）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均無其他嚴(yán)重合并癥，無代謝性疾病，所有患者術(shù)前均行MRI或CT檢查，且均為首次行手術(shù)治療，術(shù)前未進(jìn)行過放化療。根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)來對其進(jìn)行組織學(xué)分級，其中，將Ⅰ級和Ⅱ級人腦膠質(zhì)瘤患者作為低度惡性膠質(zhì)瘤組（實(shí)驗(yàn)組1），共17例，其中，Ⅰ級8例，Ⅱ級9例；Ⅲ級和Ⅳ級人腦膠質(zhì)瘤患者作為高度惡性膠質(zhì)瘤組（實(shí)驗(yàn)組2），共19例，其中，Ⅲ級12例，Ⅳ級7例。選擇同期在我院行外科手術(shù)治療腦外傷患者15例為對照組，其中，女8例，男7例，年齡13～84歲，平均（42.57±7.14）歲，均經(jīng)我院病理科檢驗(yàn)證實(shí)為正常腦組織。本研究經(jīng)我院倫理委員會通過，患者對本研究知情同意并簽署知情同意書。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組患者的年齡、性別等一般情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法采用S-P法進(jìn)行ADAM17和EGFR表達(dá)檢測，步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。PBS代替一抗作為陰性對照。采用已知陽性表達(dá)的膠質(zhì)瘤標(biāo)本作為陽性對照。鏡下觀察標(biāo)本。ADAM17表達(dá)顯示無陽性細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞膜未著色為陰性；細(xì)胞膜著色不完整（+），陽性細(xì)胞數(shù)<30%，為弱陽性；細(xì)胞膜中度著色（++），陽性細(xì)胞數(shù)30%～70%，為中等陽性；細(xì)胞膜強(qiáng)著色（+++）或陽性細(xì)胞數(shù)>70%，為強(qiáng)陽性。EGFR蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽性結(jié)果以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)陽性細(xì)胞率及染色強(qiáng)度按下述標(biāo)準(zhǔn)分級：陰性（-）：隨機(jī)視野中未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞；弱陽性：胞漿內(nèi)均勻分布淺棕黃色反應(yīng)，陽性細(xì)胞數(shù)<25%；中等陽性（++）：深棕黃色反應(yīng)，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%；強(qiáng)陽性（+++）：呈棕黑色反應(yīng)，陽性細(xì)胞數(shù)>50%。

1.2.2 Western blot法將凍存的腦組織經(jīng)常規(guī)裂解液裂解和均漿后，提取腦細(xì)胞總蛋白50 μg，經(jīng)變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白為參照，封閉后，分別加入抗ADAM17、EGFR一抗（1∶1000 稀釋），4℃過夜，沖洗，加入二抗室溫震蕩孵育1 h，洗滌后，采用化學(xué)發(fā)光顯影定影，并采用影像系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17和EGFR免疫組織化學(xué)結(jié)果

在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ADAM17陽性表達(dá)主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，呈黃色、棕黃色或黃褐色。在對照組腦組織細(xì)胞中呈微量表達(dá)，以弱陽性為主。在實(shí)驗(yàn)組1中以陽性表達(dá)為主，在實(shí)驗(yàn)組2以強(qiáng)陽性表達(dá)為主。

EGFR蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞胞漿和胞膜，為棕黃色或棕褐色顆粒。在實(shí)驗(yàn)組1患者腦組織中著色淺，陽性細(xì)胞數(shù)少；在實(shí)驗(yàn)組2患者腦組織中著色深，陽性細(xì)胞數(shù)多，分布密集。

2.2 ADAM17和EGFR Western blot結(jié)果

與對照組比較，膠質(zhì)瘤患者腦組織中ADAM17和EGFR含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。實(shí)驗(yàn)組2患者腦組織中ADAM17和EGFR表達(dá)較實(shí)驗(yàn)組1高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見表1。

表1 各組ADAM17和EGFR的表達(dá)比較（x±s）

注：與對照組比較，aP < 0.05；與實(shí)驗(yàn)組1比較，bP < 0.05；ADAM17：解聚素-金屬蛋白酶17；EGFR：上皮生長因子受體

3 討論

膠質(zhì)瘤在我國發(fā)病率較高，約占所有原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的60%，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高和治愈率低的特點(diǎn)[4]，其病因至今尚未完全明確。據(jù)多年來流行病學(xué)的調(diào)查研究及實(shí)驗(yàn)與臨床觀察顯示，可能與家族聚集性及遺傳、飲食、吸煙及飲酒、職業(yè)暴露和環(huán)境致癌物、電磁場、電離輻射、手機(jī)、疾病等諸多刺激因素有關(guān)。這些因素均可使正常組織或胚胎殘留組織受到影響，一方面無限制增殖，另一方面凋亡減少，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。治療上主要以手術(shù)切除為主，目前準(zhǔn)確的組織學(xué)診斷對指導(dǎo)手術(shù)及術(shù)后相關(guān)治療具有重要意義。有研究顯示，ADAM17和EGFR在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等方面有著重要的影響，因此它在腫瘤的診斷、治療、遠(yuǎn)期預(yù)后中存在著潛在的價(jià)值[7]。

ADAMs（a disintegrin and metalloproteinase）家族有20余種成員，它包含了金屬蛋白酶區(qū)、富半胱胺氨酸區(qū)、去整合素區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)、信號肽區(qū)、前調(diào)控區(qū)、上皮生長因子區(qū)。它們參與了生育、黏附、遷移、炎癥、肌管形成、蛋白水解、細(xì)胞傳導(dǎo)以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能。ADAM17是ADAM家族的一種，在蛋白水解、生物活性因子釋放、細(xì)胞黏附、融合、遷移及信號傳遞等過程中發(fā)揮著重要作用[8]。ADAM17在很多類型的細(xì)胞中都有表達(dá)，例如胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等。目前，許多學(xué)者通過進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADAM17在多種惡性腫瘤中表達(dá)呈陽性，且明顯高于正常組織或細(xì)胞。許多研究運(yùn)用免疫組化SP法、RT-PCR、Western-blot等方法在mRNA及蛋白水平研究了ADAM17與膠質(zhì)瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者ADAM17表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目呈正相關(guān)，表明ADAM17與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[9]。其發(fā)生機(jī)制可能與ADAM17參與調(diào)節(jié)細(xì)胞使其黏附于相鄰細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。

有學(xué)者對腦膠質(zhì)瘤組織ADAM17的表達(dá)進(jìn)行了大量試驗(yàn)及臨床研究，結(jié)果顯示，ADAM17在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，且在高度惡性的膠質(zhì)瘤中ADAM17的表達(dá)較低度惡性膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異顯著，從而提示腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程與ADAM17有關(guān)。同時(shí)也有研究證實(shí)，ADAM17在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)同膠質(zhì)瘤的惡性程度密切關(guān)系[10-11]，與本研究結(jié)果相一致。本研究應(yīng)用免疫組化和Western blot法檢測人腦膠質(zhì)瘤組織ADAM17蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，ADAM17在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，且在高度惡性膠質(zhì)瘤中表達(dá)更為強(qiáng)烈。提示ADAM17可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。有研究顯示，ADAM17具有蛋白剪切酶樣的作用，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、運(yùn)動能力等，其機(jī)制可能為，ADAM17調(diào)節(jié)細(xì)胞使其黏附于相鄰細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的起始步驟。因此，ADAM17可作為膠質(zhì)瘤病理分級及判斷預(yù)后的輔助指標(biāo)之一[12]。ADAM17的基因結(jié)構(gòu)、生理功能、調(diào)節(jié)機(jī)制及與腫瘤的關(guān)系逐漸被人們認(rèn)識。這為腦膠質(zhì)瘤抗腫瘤的靶向治療提供了可靠的依據(jù)。

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種原發(fā)性腫瘤。有大量資料報(bào)道該腫瘤的形成和發(fā)展與血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞黏附等因素密切相關(guān)。在人腦惡性膠質(zhì)瘤中常常出現(xiàn)擴(kuò)增、重排、突變和過度表達(dá)，借助于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞生長失控和轉(zhuǎn)化[13]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞沿著神經(jīng)纖維的走行或者是沿著血管周圍間隙附著在血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移，且與腫瘤的惡行程度密切相關(guān)。

EGFR是皮生長因子受體家族成員，分子量為170 000，在多種腫瘤組織中有過度表達(dá)，如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎臟、前列腺和子宮頸癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。EGFR具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體，活性與各種腫瘤發(fā)生發(fā)育過程密切相關(guān)，包括破壞細(xì)胞周期，抑制血管生成、發(fā)展，影響腫瘤細(xì)胞凋亡、遷徙和轉(zhuǎn)移等。EGFR與配體結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，從而激活體內(nèi)下游多種細(xì)胞信號蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖，而在腫瘤中則可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、新生血管形成、侵襲與轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。早在1985年有學(xué)者報(bào)道EGFR在人膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，其活化是多種腫瘤增長的重要信號之一，并證實(shí)與腫瘤惡性程度有關(guān)[14]。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展過程中，EGFR發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異?？纱龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[15]。有實(shí)驗(yàn)表明，EGFR是膠質(zhì)瘤分化程度的重要標(biāo)志，陽性表達(dá)程度與膠質(zhì)瘤的惡性度密切相關(guān)，并呈正相關(guān)。EGFR作為一種生物學(xué)指標(biāo)，是判斷腫瘤預(yù)后的重要參數(shù)之一。也有研究顯示，EGFR在腫瘤細(xì)胞膜信息轉(zhuǎn)換中起著重要作用，EGFR的過度表達(dá)不斷刺激細(xì)胞分裂增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。曾有研究結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)和新生血管旁EGFR均有高度表達(dá)。有學(xué)者對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)研究，表明VEGF可以通過旁分泌方式作用于腫瘤旁血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的靶受體，從而發(fā)揮作用，因此揭示VEGF是也一種重要的旁分泌血管生長因子。關(guān)于EGFR與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)性報(bào)道較少。有研究證實(shí)，EGFR在膠質(zhì)瘤中常常過度表達(dá)，且其過表達(dá)和患者惡性預(yù)后相關(guān)。研究表明，在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的表達(dá)增高或表達(dá)異常。EGFR與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)，其可能機(jī)制為EGFR的表達(dá)異常引起下游信號傳導(dǎo)的增強(qiáng)[10]。有研究表明EGFR在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)率可達(dá)25%～50%，并且有EGFR基因的擴(kuò)增。國外文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用EGFR基因單克隆抗體治療腦膠質(zhì)瘤有一定的效果。膠質(zhì)瘤在實(shí)驗(yàn)室中已取得很好的療效。本研究采用免疫組化法及Western blot法檢測EGFR在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于對照組，且在高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)顯著高于低級別膠質(zhì)瘤，提示其表達(dá)陽性率和強(qiáng)度與人腦膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)。

隨著對ADAM17和EGFR在腦膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中作用機(jī)制的逐步深入研究，其在膠質(zhì)瘤的治療中所具有的潛在價(jià)值逐漸突顯，可考慮將其作為抗癌藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2014-07-22 本文編輯：程銘）