NaHCO3堿度對(duì)5 種幼魚(yú)的生存及鰓、腎組織的影響

楊 建，徐 偉，耿龍武，關(guān)海紅，黨云飛，李晨宇

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

我國(guó)約有6.9×108hm2低洼鹽堿水域，約占全國(guó)湖泊總面積的55%［1］。這些水資源的主要特點(diǎn)是鹽堿度高，緩沖能力差［2］，生物資源貧乏，漁業(yè)產(chǎn)量一直處于較低水平。因此，掌握不同魚(yú)類(lèi)對(duì)鹽堿的耐受性及調(diào)控機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)和利用這些水域具有重要的意義。近年來(lái)，針對(duì)鹽度對(duì)魚(yú)類(lèi)的受精孵化率、生長(zhǎng)發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)和酶活力影響等進(jìn)行了較多研究［3-5］，但堿度對(duì)魚(yú)類(lèi)的影響報(bào)道則相對(duì)較少。

2003 年黑龍江水產(chǎn)研究所從烏茲別斯坦外引進(jìn)了耐鹽堿魚(yú)類(lèi)大鱗鲃(Barbus capito)，該魚(yú)屬鯉科，鲃亞科，鲃屬，溯河洄游性魚(yú)類(lèi)，具有食性廣、生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮美、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)［6］。目前，大鱗鲃的人工繁育已獲得成功［7］，為大鱗鲃的推廣奠定了基礎(chǔ)。目前，我國(guó)低洼鹽堿水域面臨著養(yǎng)殖品種單一，生產(chǎn)效益不高等難題［2］，急需引入新的耐鹽堿魚(yú)類(lèi)品種，本研究比較了大鱗鲃與草魚(yú)(Ctenopharyngodon idllus)、鏡鯉(Songpu mirror carp)、鯽魚(yú)(Carassius auratus)和白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)等幾種常見(jiàn)池塘養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)在NaHCO3堿度脅迫下的耐受性能及其對(duì)組織影響，以期為鹽堿水域的漁業(yè)開(kāi)發(fā)利用提供參考。本研究利用NaHCO3溶液對(duì)大鱗鲃、草魚(yú)、鏡鯉、鯽魚(yú)和白鰱進(jìn)行堿度急性毒性試驗(yàn)，比較5 種幼魚(yú)對(duì)堿度的耐受性，并通過(guò)鰓、腎組織的病理切片觀察，探索魚(yú)類(lèi)在高堿脅迫下不同魚(yú)類(lèi)組織結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大鱗鲃、草魚(yú)、鏡鯉、鯽魚(yú)和白鰱均為黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站培育50 d 左右的健康幼魚(yú)。試驗(yàn)前在室內(nèi)停食暫養(yǎng)2 d，試驗(yàn)用水為曝氣的池塘用水，鹽度為0.56 g/L，堿度為4.2 mmol/L，pH 為7.93，硬度為234 mg/L，氨氮0.69 mg/L 和總鐵0.64 mg/L。試驗(yàn)容器是規(guī)格為64 cm×45 cm×28 cm白色硬質(zhì)塑料箱，試驗(yàn)用NaHCO3及其它藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前進(jìn)行5 種幼魚(yú)NaHCO3脅迫預(yù)實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)置5 個(gè)堿度梯度及1 個(gè)對(duì)照組，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值。試驗(yàn)溶液按每組50 L 水稱取相應(yīng)質(zhì)量的NaHCO3配制，配制好后穩(wěn)定24 h，用滴定法測(cè)定每個(gè)試驗(yàn)組的堿度，對(duì)濃度偏差較大的組別進(jìn)行調(diào)整并再次測(cè)定其濃度，5 種魚(yú)類(lèi)的NaHCO3預(yù)設(shè)濃度和實(shí)測(cè)濃度見(jiàn)表1。每個(gè)濃度組隨機(jī)放入幼魚(yú)10 尾，試驗(yàn)期間不換水，不通氣，靜止放置96 h。試驗(yàn)期間溶解氧含量為6.53～6.71 mg/L，氨氮含量為，0.69～0.77 mg/L，溫度為21.5～23.5 ℃。對(duì)5 種幼魚(yú)死亡的判別標(biāo)準(zhǔn)是:幼魚(yú)失去游泳能力，輕觸魚(yú)體無(wú)反應(yīng)即視為死亡。

表1 5 種幼魚(yú)堿度試驗(yàn)濃度梯度Tab.1 Concentration gradient of alkalinity in juveniles of 5 species

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、樣本采集及檢測(cè)

觀察和統(tǒng)計(jì)12 h，24 h，48 h，72 h，96 h 各濃度組試驗(yàn)魚(yú)的活動(dòng)情況，記錄死亡時(shí)間和尾數(shù)，并立即采集死亡個(gè)體的鰓、腎組織。每種魚(yú)每種組織分別取3 個(gè)樣，浸泡在Bouins 液中固定。固定24 h 后，用70%的乙醇洗滌2～3 次，再保存于70%的乙醇中。固定好的組織用石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，HE 染色，中性樹(shù)膠封片，用Motic 2.0 光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 軟件(07 版)整理，并采用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS17.0 進(jìn)行方差分析和半數(shù)致死濃度的計(jì)算［8］，P＜0.05 視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用t-檢驗(yàn)對(duì)5 種魚(yú)類(lèi)的24 h，48 h，72 h，96 h 的堿度半致死濃度(Half lethal concentration，LC50)進(jìn)行差異分析，P＜0.05 為差異顯著。采用安全濃度(Safe Concentration，SC)常用計(jì)算公式SC=96 h LC50×0.1［9］計(jì)算出堿度對(duì)5 種魚(yú)類(lèi)的安全濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3堿度脅迫下5 種幼魚(yú)的行為反應(yīng)

5 種幼魚(yú)放入高濃度NaHCO3溶液后，初期表現(xiàn)為繞試驗(yàn)容器迅速的游動(dòng)，大鱗鲃、鏡鯉、鰱魚(yú)甚至出現(xiàn)跳出容器;隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，幼魚(yú)出現(xiàn)狂游，且在游動(dòng)時(shí)，身體出現(xiàn)側(cè)翻現(xiàn)象，無(wú)法維持身體平衡;隨后，幼魚(yú)的游泳速度逐漸變得緩慢，活動(dòng)減弱，對(duì)外界刺激反應(yīng)減弱，最后死亡;在魚(yú)體死亡前，鯽魚(yú)雖無(wú)鰓動(dòng)，但較長(zhǎng)時(shí)間仍能對(duì)外界刺激有反應(yīng)，而其它幼魚(yú)無(wú)鰓動(dòng)即刻死亡;5 種幼魚(yú)出現(xiàn)異常反應(yīng)的時(shí)間都會(huì)隨著NaHCO3濃度的升高而縮短。在試驗(yàn)期間幼魚(yú)體表粘液的分泌則減少，魚(yú)體表層變黑，失去光澤，個(gè)別眼睛發(fā)白，鰓部出血。而對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)期間，5 種幼魚(yú)游泳行為正常，體表無(wú)異常變化，無(wú)死亡現(xiàn)象。

表2 5 種幼魚(yú)在不同NaHCO3濃度下的死亡率Tab.2 Mortality in different concentrations of NaHCO3in juveniles of 5 species

2.2 不同NaHCO3濃度下的死亡率

5 種幼魚(yú)在不同NaHCO3濃度下12 h，24 h，48 h，72 h 和96 h 時(shí)的死亡率見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，5 種幼魚(yú)的死亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、NaHCO3濃度的增大而升高，毒性效應(yīng)與曝露時(shí)間、NaHCO3濃度呈正相關(guān)。

2.3 不同NaHCO3濃度下的半致死濃度

通過(guò)5 種幼魚(yú)的死亡率計(jì)算獲得NaHCO3半致死濃度，以及死亡率與NaHCO3濃度的關(guān)系方程(表3)。5 種幼魚(yú)的NaHCO3堿度96 h 半致死濃度(LC50)分別為:大鱗鲃123.097 mmol/L，草魚(yú)92.936 mmol/L，鏡鯉113.038 mmol/L，鯽魚(yú)139.832 mmol/L，白鰱87.970 mmol/L，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算得出5 種幼魚(yú)的NaHCO3安全濃度分別為12.310 mmol/L，9.294 mmol/L，11.304 mmol/L，13.983 mmol/L，8.797 mmol/L。由5 種幼魚(yú)的NaHCO3半致死濃度和安全濃度可知，耐受能力大小順序依次為:鯽魚(yú)，大鱗鲃，鏡鯉，草魚(yú)，白鰱。

表3 5 種幼魚(yú)的急性堿度半致死濃度Tab.3 Acute LC50of alkalinity in juveniles of 5 species

對(duì)5 種魚(yú)類(lèi)幼魚(yú)的曝露時(shí)間和對(duì)應(yīng)的NaHCO3半致死濃度作圖，得到5 種幼魚(yú)的NaHCO3濃度反應(yīng)曲線(圖1)。5 種魚(yú)類(lèi)的NaHCO3半致死濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，大鱗鲃、鏡鯉和白鰱的NaHCO3毒性反應(yīng)曲線趨于平緩，這表明幼魚(yú)的NaHCO3LC50不再繼續(xù)降低，死亡率不再升高;草魚(yú)和鯽魚(yú)的NaHCO3毒性反應(yīng)曲線仍呈下降的趨勢(shì)，死亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)仍有所降低。由圖1 可知，鏡鯉在曝露48 h 時(shí)反應(yīng)曲線即趨于平穩(wěn)，鯽魚(yú)和白鰱在曝露72 h 趨于平穩(wěn)，而大鱗鲃和草魚(yú)在試驗(yàn)終止反應(yīng)曲線也未完全與橫軸平行，這說(shuō)明在堿度脅迫下的適應(yīng)時(shí)間鏡鯉最短，其次為鯽魚(yú)和白鰱，大鱗鲃和草魚(yú)較長(zhǎng)。

2.4 NaHCO3堿度脅迫下5 種幼魚(yú)鰓、腎組織的結(jié)構(gòu)變化

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組5 種幼魚(yú)的鰓絲分布均勻，細(xì)胞飽滿，排列緊密;鰓小片均勻的分布在鰓絲兩側(cè)，鰓小片上皮細(xì)胞飽滿無(wú)損傷，大鱗鲃、鯽魚(yú)和鏡鯉的鰓絲較草魚(yú)、白鰱密集，鰓小片結(jié)構(gòu)也較草魚(yú)和白鰱復(fù)雜(圖2，1～5)。但在高濃度NaHCO3脅迫下，鰓結(jié)構(gòu)變化基本相同，鰓小片縮短，細(xì)胞間隙增大，鰓小片上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的水腫，甚至脫落現(xiàn)象(圖2，6～10)。

圖1 5 種幼魚(yú)的急性堿度反應(yīng)Fig.1 Acute alkalinity response in juveniles of 5 species

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的腎組織結(jié)構(gòu)充實(shí)，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯;結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞無(wú)損傷，5 種幼魚(yú)的腎組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯的差異(圖3，11～15)。但在高NaHCO3濃度試驗(yàn)組中，腎小管上皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不同程度的萎縮，腎小管管腔變大(圖3，11～15)。

圖2 NaHCO3對(duì)5 種幼魚(yú)鰓組織的影響Fig.2 Impact of NaHCO3on gill structure in juveniles of 5 species

圖3 NaHCO3對(duì)5 種魚(yú)類(lèi)腎臟組織的影響Fig.3 Impact of NaHCO3on kidney structure in juveniles of 5 species

3 討論

3.1 NaHCO3堿度對(duì)魚(yú)類(lèi)的急性毒性作用

我國(guó)低洼鹽堿地區(qū)的水型較復(fù)雜，離子組成不盡相同，其中CO32-、HCO3-是影響水體中堿度的主要離子，直接或間接的影響了水生生物的生長(zhǎng)和生存［10］。一般在實(shí)驗(yàn)室條件下，多數(shù)研究者都會(huì)使用NaHCO3濃度作為生物耐堿能力的指標(biāo)［5，11-12］。魚(yú)類(lèi)在高堿度水體中，組織器官會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的損傷和結(jié)構(gòu)變化。史為良在對(duì)達(dá)里湖魚(yú)類(lèi)進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)雅羅魚(yú)體表潰爛，爛鰭或瞎眼［13］，雷衍之等報(bào)道在高堿度水體中鰱魚(yú)、鳙魚(yú)(Aristichthys nobilis)和草魚(yú)鰓部出血［14］。本研究選擇NaHCO3進(jìn)行了5 種魚(yú)類(lèi)的堿度毒性試驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)在高堿度溶液中魚(yú)體表層變黑，失去光澤，個(gè)別個(gè)體出現(xiàn)眼睛發(fā)白、鰓部出血現(xiàn)象。

史為良在對(duì)達(dá)里湖魚(yú)類(lèi)進(jìn)行調(diào)查時(shí)認(rèn)為魚(yú)類(lèi)的死亡是由高pH 與高堿度的共同作用引起，并發(fā)現(xiàn)達(dá)里湖魚(yú)類(lèi)的死亡與CO32-、HCO3-的含量有關(guān)［13］;雷衍之等在研究碳酸鹽對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性作用時(shí)著重分析了CO32-、HCO3-和OH-的相互作用關(guān)系，得出堿度相同時(shí)，pH 越高，致死作用越大;pH 相同時(shí)，堿度越大，致死作用也越大。在高堿度條件下，幾種魚(yú)類(lèi)的耐受能力大小依次為青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)，瓦氏雅羅魚(yú)(Leuciscus waleckii)，鯽魚(yú)，鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)，尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)，草魚(yú)，鳙魚(yú)，鰱魚(yú)［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)在正常pH 范圍內(nèi)，5 種幼魚(yú)死亡率隨著NaHCO3濃度增大、曝露時(shí)間、延長(zhǎng)而升高，且不同品種的幼魚(yú)對(duì)堿度的耐受力存在顯著差異，耐受力大小依次為鯽魚(yú)，大鱗鲃，鏡鯉，草魚(yú)，鰱魚(yú)，這些結(jié)果與史為良和雷衍之等研究結(jié)果相近。

研究表明，廣鹽性硬骨魚(yú)類(lèi)由淡水中轉(zhuǎn)入高鹽度水體中，魚(yú)體組織結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性改變［15-16］，魚(yú)類(lèi)在堿性水體中也存在相似的適應(yīng)性變化，但這種適應(yīng)不能超過(guò)魚(yú)體的耐受極限［17-19］。此外，魚(yú)類(lèi)對(duì)堿度的適應(yīng)因種類(lèi)的不同而呈現(xiàn)多樣性，本研究發(fā)現(xiàn)5 種魚(yú)類(lèi)曝露在相同堿度下出現(xiàn)的生理反應(yīng)和效應(yīng)時(shí)間各有差異，如鯽魚(yú)在死亡前，雖無(wú)鰓動(dòng)，但較長(zhǎng)時(shí)間仍能對(duì)外界刺激有反應(yīng)，而其它幼魚(yú)無(wú)鰓動(dòng)即刻死亡。

3.2 NaHCO3堿度對(duì)魚(yú)類(lèi)鰓、腎組織結(jié)構(gòu)的影響

鰓是魚(yú)類(lèi)與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的主要器官，易于受到外界環(huán)境的干擾而影響其正常生理功能的進(jìn)行。魚(yú)類(lèi)在對(duì)堿度脅迫的適應(yīng)過(guò)程中，鰓的組織結(jié)構(gòu)也發(fā)生不同程度的適應(yīng)性改變。姜秋俚等發(fā)現(xiàn)高NaHCO3作用下咸?？ɡ佐~(yú)(Chalcalburnus chalcoides aralensis)的鰓小片縮短，鰓小片上皮細(xì)肥大，腫脹和脫落［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)在高堿度試驗(yàn)組中，5 種試驗(yàn)幼魚(yú)的鰓小片縮短，細(xì)胞間隙增大，導(dǎo)致鰓絲萎縮。這是由于水體中的堿度增大，部分離子進(jìn)入血液中，血漿的滲透壓會(huì)升高，魚(yú)體為了滿足滲透調(diào)節(jié)的能量需求，鰓組織結(jié)構(gòu)隨即發(fā)生適應(yīng)性變化。筆者認(rèn)為鰓絲萎縮使得鰓小片間隙增大，流經(jīng)鰓絲的水量增大;鰓絲直徑減小，使得比表面積*增大，這些都會(huì)有利于氧氣的攝取及能量物質(zhì)的分解，這一結(jié)論還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

魚(yú)類(lèi)的腎臟是魚(yú)體進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的重要器官，外界環(huán)境的異常會(huì)導(dǎo)致腎組織結(jié)構(gòu)相應(yīng)的變化，因此，可作為魚(yú)類(lèi)鹽堿度適應(yīng)范圍和最適鹽堿度的指標(biāo)［21］。研究發(fā)現(xiàn)，在低滲環(huán)境下腎組織結(jié)構(gòu)充實(shí)，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯;而在高滲條件下，腎臟會(huì)退化，腎小球縮小甚至消失，腎小管縮短［22］。D L Galat等對(duì)生活在不同鹽堿湖泊的褐色鮭(Salmo clarki lewisi)等的腎臟進(jìn)行觀察時(shí)也得到了相同的結(jié)論［23］，姜秋俚等也發(fā)現(xiàn)在NaHCO3堿度脅迫下卡拉白魚(yú)的腎臟也發(fā)生類(lèi)似的變化［17］。本試驗(yàn)對(duì)照組幼魚(yú)腎臟組織結(jié)構(gòu)充實(shí)，腎小球發(fā)達(dá)，腎小管粗壯，但在高濃度NaHCO3試驗(yàn)組也觀察到的腎組織腎小管出現(xiàn)不同程度的萎縮，腎小管管腔變大。這可能是由于在高堿度水體中，魚(yú)體的滲透壓會(huì)隨之升高，為了維持體內(nèi)的平衡，魚(yú)體就會(huì)補(bǔ)充大量的水分，這時(shí)腎組織排出的水分相應(yīng)減少，而腎小管就會(huì)出現(xiàn)不同程度的萎縮。

在高鹽堿水體中，魚(yú)類(lèi)除了鰓和腎臟組織參與離子的調(diào)控和滲透壓的調(diào)節(jié)，Nelsen 等在對(duì)褐色鮭的研究中發(fā)現(xiàn)，幽門(mén)盲囊也參與了滲透壓的調(diào)節(jié)［24］。此外，童燕，Rotllant J 和徐力文等認(rèn)為魚(yú)體中腎上腺皮質(zhì)激素［25］、消化酶、堿性磷酸酶和非特異性免疫酶類(lèi)［26-27］等參與滲透壓的調(diào)節(jié)。由此可知，魚(yú)類(lèi)在異常的鹽堿環(huán)境中滲透壓調(diào)節(jié)是由多個(gè)器官間協(xié)同作用來(lái)維持的，因而要想查清魚(yú)類(lèi)在鹽堿條件下的滲透壓調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

* 注:比表面積(specific surface area)是指單位質(zhì)量物料所具有的總面積，是表示固體吸附能力的重要參數(shù)。比表面和粒度有一定關(guān)系的，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB1774-88 比表面與粉末粒度關(guān)系的計(jì)算公式(假定為球形)為:d=6/ps，其中d—平均粒徑(μm)，ρ—密度(g/cm3)，S—比表面(m2/g)。

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