唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾的亞致死效應(yīng)研究

陳潔瓊，江 瑛，陳 瓊，黃水金*，李保同

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330200)

小菜蛾(Plutella xylostella)屬于鱗翅目菜蛾科，是世界性的十字花科蔬菜主要害蟲［1］。由于其年發(fā)生代數(shù)多，繁殖系數(shù)高，危害極為嚴(yán)重?；瘜W(xué)藥劑一直是防治小菜蛾的主要手段，由于長(zhǎng)期的不合理用藥，導(dǎo)致抗藥性十分嚴(yán)重，如對(duì)氯蟲苯甲酰胺等均產(chǎn)生了較高的抗性水平［2-3］。唑蟲酰胺(tolfenpyrad)為新型吡唑雜環(huán)類殺蟲殺螨劑，其作用機(jī)理為阻礙線粒體代謝系統(tǒng)中的電子傳遞系統(tǒng)復(fù)合體I，從而使電子傳遞受到阻礙，使昆蟲不能提供和貯存能量，被稱為線粒體電子傳達(dá)復(fù)合體阻礙劑(METI)［4］。該藥劑對(duì)多種螨類以及鱗翅目、半翅目、膜翅目、雙翅目和纓翅目害蟲均有效，特別是對(duì)小菜蛾、薊馬和茶葉小綠葉蟬有特效［4］。目前，尚未見田間害蟲對(duì)唑蟲酰胺產(chǎn)生抗性的報(bào)道。已有研究表明，大田使用殺蟲劑除可直接殺死靶標(biāo)害蟲，其在環(huán)境中的毒力隨著時(shí)間的延續(xù)會(huì)逐漸遞減到亞致死劑量，可能造成昆蟲生態(tài)行為、生殖力、發(fā)育歷期和抗藥性的變化［5-7］。隨著唑蟲酰胺的廣泛應(yīng)用，其對(duì)害蟲的選擇壓力也將隨之增大，施用后同樣可能存在田間亞致死效應(yīng)。為此，筆者研究了唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾3 齡幼蟲的亞致死效應(yīng)，旨在為唑蟲酰胺的合理應(yīng)用及小菜蛾的綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx 供試小菜蛾采自江西省南昌縣郊區(qū)菜地，幼蟲參照蛭石蘿卜苗法［8］飼養(yǎng)。幼蟲化蛹后，轉(zhuǎn)至25 cm×15 cm×25 cm(長(zhǎng)×寬×高)的養(yǎng)蟲紗籠內(nèi)羽化，籠內(nèi)放置沾有10%蜂蜜水的棉球供成蟲取食，以及1 盆高約10 cm 的新鮮蘿卜苗供其產(chǎn)卵。每天更換新鮮蘿卜苗并補(bǔ)充糖水，將帶卵蘿卜苗放入60 cm×30 cm×25 cm(長(zhǎng)×寬×高)的養(yǎng)蟲籠內(nèi)孵化和飼養(yǎng)。

1.1.2 供試藥劑、試劑及儀器 15%唑蟲酰胺水乳劑(江西正邦生物化工股份有限公司技術(shù)部配制)，α-乙酸萘酯(α-NA，廣州齊云生物技術(shù)有限公司，分析純)，固藍(lán)RR 鹽(南京生工進(jìn)口分裝)，對(duì)硝基苯甲醚(β-NA，瑞士Adamas-beta 公司，分析純)，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)(Roche，進(jìn)口分裝)，牛血清白蛋白和考馬斯亮藍(lán)G-250(上海藍(lán)季科技發(fā)展公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫代蘇糖醇(DTT)、苯基硫脲(PTU)、2，4-二硝基氯苯(CDNB)、還原性谷胱甘肽(GSH)均為國(guó)產(chǎn)分析純。UV9100 型紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物測(cè)定 毒力測(cè)定采用浸葉法［9］:取新鮮甘藍(lán)葉片，清洗擦拭干凈后，用打孔器打成直徑約6 cm的圓片，分別置于用水稀釋的系列濃度的藥液中，浸漬10 s 后取出，晾干，放入φ7 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿接入小菜蛾3 齡中期幼蟲10 頭，置于溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度65%±5%、光周期14L:10D 的人工養(yǎng)蟲室中飼養(yǎng)。每處理重復(fù)4 次，并設(shè)清水作對(duì)照。每隔24 h 觀察記錄試蟲死亡情況，并于處理后72 h統(tǒng)計(jì)死亡率，計(jì)算毒力回歸方程、LC30和LC50。

1.2.2 生物學(xué)特性觀察 按毒力回歸方程計(jì)算的LC30和LC50值配制唑蟲酰胺藥液，參照1.2.1 方法對(duì)小菜蛾3 齡中期幼蟲進(jìn)行藥劑處理和飼養(yǎng)，處理后72 h 將存活幼蟲轉(zhuǎn)入無毒的新鮮甘藍(lán)葉片上繼續(xù)飼養(yǎng)。每處理重復(fù)10 次，并設(shè)清水處理作對(duì)照。對(duì)藥前和藥后72 h 的幼蟲以及化蛹當(dāng)日的蛹稱量，以后每隔24 h 觀察記錄幼蟲發(fā)育進(jìn)度與死亡、幼蟲化蛹與蛹期及成蟲羽化情況。將相同濃度同日羽化的雌雄成蟲放入口徑為7 cm 的一次性塑料杯內(nèi)配對(duì)產(chǎn)卵，杯中放置一小團(tuán)浸有10%糖水的棉球?yàn)槌上x補(bǔ)充能量，每個(gè)處理配對(duì)20～30 對(duì)，每天更換棉球并記錄成蟲壽命和產(chǎn)卵數(shù)量。

1.2.3 幼蟲體內(nèi)解毒酶活性測(cè)定 按毒力回歸方程計(jì)算的LC30和LC50值配制唑蟲酰胺藥液，參照1.2.1方法對(duì)小菜蛾3 齡中期幼蟲進(jìn)行藥劑處理和飼養(yǎng)，分別測(cè)定處理后24，48，72 h 存活幼蟲體內(nèi)解毒酶活性。

酶原制備:①酯酶:挑選5 頭幼蟲，加入1 000 μL 磷酸緩沖液(0.1 mmol/L，pH=7.0，含0.1%TritonX-100)冰浴勻漿2 min。②谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶:挑取5 頭幼蟲，加入1 000 μL 磷酸緩沖液(0.1 mmol/L，pH=7.0，含1 mmol/L EDTA)冰浴勻漿2 min。③多功能氧化酶:挑取5 頭幼蟲，加入1 100 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.8，含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU 和1 mmol/L PMSF)冰浴勻漿2 min。將勻漿液于4 ℃10 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液在4 ℃12 000 r/min條件下離心30 min，最后所得上清液作為酶原備用。

酶活性測(cè)定:①酯酶:于比色皿中依次加入2 000 μL 底物與顯色劑的混合液(含2.1 mmol/Lα-NA和2.1 mmol/L 固藍(lán)RR 鹽)，900 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液和100 μL 酶液(稀釋10 倍)，混勻，27 ℃溫育5 min 后，置于分光光度計(jì)450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值。②谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶:于比色皿中加入900 μL 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液，1 000 μL 6 mmol/L GST 和1 000 μL 1.2 mmol/L 的CDNB，最后加入100 μL酶液(稀釋10 倍)，混勻，27 ℃溫育5 min，置于分光光度計(jì)340 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值。③多功能氧化酶:于比色皿中加入1 000 μL 2 mmol/L p-NA，100 μL 9.6 mmol/L NADPH 和900 μL 酶液，混勻后置于分光光度計(jì)405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定:參照Bradford［10］考馬斯亮藍(lán)G-250 法，以BSA 作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 毒力回歸方程、LC30和LC50值以及LSD 多重比較均使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行計(jì)算與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾的毒力

根據(jù)生物測(cè)定結(jié)果，利用機(jī)率值分析法建立的唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾的毒力回歸方程為y=2.727 4+2.185 9x，R2=0.964 3，LC30值為6.306 1 mg/L，LC50值為10.955 5 mg/L(95% 置信限為8.956 3～13.416 2 mg/L)。以此LC30和LC50值作為以下研究的藥劑亞致死濃度。

2.2 唑蟲酰胺亞致死濃度對(duì)小菜蛾幼蟲體質(zhì)量及蛹質(zhì)量的影響

參試的不同處理組幼蟲的初始體質(zhì)量無顯著性差異，而處理后72 h 不同處理組存活的幼蟲體質(zhì)量存在差異(表1)。其中，CK 組的幼蟲體質(zhì)量最大，平均為3.08 mg/頭，分別為L(zhǎng)C30和LC50處理組幼蟲體質(zhì)量的2.5 倍和2.9 倍，均顯著高于2 個(gè)藥劑處理組。CK 組的雌雄蛹質(zhì)量分別為5.18 mg/頭和6.13 mg/頭，均明顯高于2 個(gè)用藥處理組。同時(shí)，高濃度藥劑處理組幼蟲體質(zhì)量和蛹質(zhì)量均低于低濃度藥劑處理組，但彼此間差異不顯著。由此表明，唑蟲酰胺亞致死濃度可顯著降低小菜蛾幼蟲和蛹的體質(zhì)量。

表1 亞致死濃度唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾幼蟲體質(zhì)量及蛹質(zhì)量的影響Tab.1 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on the body mass of larval and pupal of Plutella xylostella(L.)

2.3 唑蟲酰胺亞致死濃度對(duì)小菜蛾生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖的影響

藥劑處理后，小菜蛾幼蟲和蛹的發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)，其中LC30和LC50處理組從3 齡幼蟲發(fā)育至4 齡幼蟲的時(shí)間分別延長(zhǎng)0.46 d 和0.56 d(表2)，用藥后小菜蛾3 齡至蛹發(fā)育歷期可以看出，唑蟲酰胺亞致死濃度處理小菜蛾3 齡幼蟲，對(duì)其幼蟲和蛹的發(fā)育有顯著的遲滯效應(yīng)。同時(shí)，唑蟲酰胺亞致死濃度可顯著降低幼蟲化蛹率、成蟲羽化率、成蟲壽命和成蟲單雌產(chǎn)卵量，

LC30和LC50處理組的化蛹率分別為77.60%和73.82%，明顯低于未用藥對(duì)照組(89.21%)，2 個(gè)藥劑處理組的羽化率亦均明顯低于對(duì)照組。此外，唑蟲酰胺還影響小菜蛾成蟲壽命，LC30和LC50處理組的成蟲壽命均顯著短于對(duì)照組的成蟲壽命。

從表2 還可看出，藥劑處理組的單雌產(chǎn)卵量均顯著低于對(duì)照組，且隨著藥劑濃度增加而降低。此外，藥劑處理組的卵孵化率也明顯低于對(duì)照組。表明亞致死濃度唑蟲酰胺處理對(duì)小菜蛾的繁殖不利。

表2 亞致死濃度唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾生長(zhǎng)發(fā)育的影響Tab.2 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on the development and reproduction of Plutella xylostella(L.)

2.4 唑蟲酰胺亞致死濃度對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響

2.4.1 唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾多功能氧化酶活性的影響 藥劑處理后24 h，LC30和LC50處理組幼蟲的多功能氧化酶活性分別為0.18 OD/(min·mg pro)和0.11 OD/(min·mg pro)，均明顯低于CK，且其活性隨著唑蟲酰胺濃度的提高而降低;藥劑處理后48 h 和72 h，LC30和LC50處理組幼蟲的多功能氧化酶活性均明顯低于CK(圖1)。由此表明，小菜蛾3 齡幼蟲經(jīng)唑蟲酰胺亞致死濃度處理后，其體內(nèi)多功能氧化酶活性受到不同程度的抑制。

圖1 亞致死濃度唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾多功能氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on MFOs activity of P.xylostella

圖2 亞致死濃度唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾酯酶活性的影響Fig.2 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on EST activity of P.xylostella

2.4.2 唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)酯酶活性的影響 藥劑處理后24，48，72 h，小菜蛾幼蟲酯酶活性顯著低于CK，其中，LC30處理組小菜蛾幼蟲酯酶活性比CK 分別降低32.02%、27.55%和28.28%，但高于LC50處理組(圖2)。由此表明，小菜蛾3 齡幼蟲經(jīng)過唑蟲酰胺亞致死濃度處理后，其體內(nèi)的酯酶活性受到不同程度抑制。

圖3 亞致死濃度唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.3 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on GSTs activity of P.xylostella

2.4.3 唑蟲酰胺亞致死濃度對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶活性的影響 藥劑處理后24，48，72 h，LC30和LC50處理組的GSTs 酶活性均顯著降低(圖3)。由此表明，小菜蛾3 齡幼蟲經(jīng)唑蟲酰胺亞致死濃度處理后，其體內(nèi)谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶活性也受到顯著的抑制。此外，LC30處理組的GSTs 酶活性波動(dòng)較大，藥后24 h 的GSTs 酶活性顯著高于LC50處理組，而藥后48 h和72 h 均顯著低于LC50處理組(圖3)。

3 討論

亞致死劑量的殺蟲劑會(huì)顯著影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育［11-13］。例如，亞致死劑量多殺菌素導(dǎo)致小菜蛾種群的化蛹率和蛹質(zhì)量顯著降低，生殖力顯著下降［14］;亞致死劑量氰戊菊酯導(dǎo)致小菜蛾的化蛹率、羽化率和蛹質(zhì)量明顯降低［15］;亞致死劑量氰氟蟲腙處理小菜蛾種群后，顯著降低其化蛹率、蛹質(zhì)量和羽化率，明顯延長(zhǎng)蛹期，縮短成蟲產(chǎn)卵期和壽命［16］;茚蟲威LC30和LC50以及高效氯氰菊酯LC15、LC30和LC50處理組各蟲態(tài)發(fā)育歷期比對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，3 齡、4 齡幼蟲和蛹的重量均顯著低于對(duì)照組，茚蟲威LC30和LC50以及高效氯氰菊酯LC30和LC50處理組小菜蛾后代的總產(chǎn)卵期顯著短于相應(yīng)對(duì)照組［17］;亞致死濃度氯蟲苯甲酰胺處理小菜蛾后，顯著延長(zhǎng)了4 齡至化蛹的歷期、顯著降低了化蛹率、蛹重和成蟲羽化率，延長(zhǎng)了成蟲的產(chǎn)卵前期［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，唑蟲酰胺LC30和LC50處理后，可延長(zhǎng)小菜蛾幼蟲和蛹的發(fā)育歷期，降低化蛹率和羽化率，縮短成蟲壽命，減輕小菜蛾幼蟲的體質(zhì)量和蛹質(zhì)量，且藥劑濃度越高幼蟲體質(zhì)量和蛹質(zhì)量越低，與前人報(bào)道的結(jié)果相似。由此推測(cè)，應(yīng)用低劑量的唑蟲酰胺防治小菜蛾，可能會(huì)導(dǎo)致田間小菜蛾種群的世代重疊，對(duì)作物的為害時(shí)間延長(zhǎng)。

本生殖研究結(jié)果表明，亞致死濃度唑蟲酰胺處理將導(dǎo)致小菜蛾的繁殖力下降，表現(xiàn)為產(chǎn)卵量及卵孵化率的降低。Kamleshk［19］報(bào)道亞致死濃度的甲胺磷和甲萘威處理小菜蛾3 齡幼蟲后，雌蟲的產(chǎn)卵量下降;Mahmoudvand［20］報(bào)道亞致死濃度的氟鈴脲處理小菜蛾后，其蛹質(zhì)量、產(chǎn)卵量、凈生殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率顯著降低。而Nemoto 等［21］報(bào)道用亞致死劑量的滅多威處理小菜蛾4 齡幼蟲后，其成蟲的繁殖力增強(qiáng)，卵的體積增大，并且卵孵化率明顯高于對(duì)照;Sotan 等［22］和Fujiwaray 等［23］報(bào)道亞致死劑量的氰戊菊酯處理小菜蛾后，使小菜蛾種群的內(nèi)稟增長(zhǎng)率提高，單雌產(chǎn)卵量比對(duì)照有所增加。這可能與藥劑的種類不同有關(guān)，但還需要進(jìn)一步證實(shí)。

酯酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶和多功能氧化酶是昆蟲體內(nèi)3 種重要的解毒酶，在昆蟲代謝藥物的過程中起著重要的作用［24］。亞致死劑量殺蟲劑處理昆蟲后，不僅影響其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，還將對(duì)害蟲體內(nèi)的解毒酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用［25-27］。梁沛等［28-29］報(bào)道亞致死劑量阿維菌素和高效氯氰菊酯處理小菜蛾后，其谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶比對(duì)照組分別提高了42%和70%，其羧酸酯酶活性也比對(duì)照顯著升高;尹顯慧等［30］報(bào)道敏感種群小菜蛾經(jīng)亞致死劑量多殺菌素處理后，其羧酸酯酶活性在不同時(shí)間段有波動(dòng)，開始時(shí)段比活力增加，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，比活力逐漸被抑制，細(xì)胞色素P450 酶系的O-脫甲基酶活性具有明顯的抑制作用但對(duì)谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶有明顯的誘導(dǎo)作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)，唑蟲酰胺亞致死濃度LC30和LC50處理小菜蛾3 齡幼蟲后，3 種解毒酶活性均明顯低于CK 組，表明亞致死劑量唑蟲酰胺對(duì)小菜蛾幼蟲體內(nèi)的酯酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶和多功能氧化酶活性有顯著的抑制作用。在藥后24 和72 h，唑蟲酰胺LC30處理組的多功能氧化酶活性均高于LC50處理組，而在藥后48 h LC30處理組多功能氧化酶活性略低于LC50處理組，說明多功能氧化酶在唑蟲酰胺的代謝中發(fā)揮了重要作用。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在藥后24、48 和72 h 小菜蛾體內(nèi)的酯酶活性表現(xiàn)出劑量效應(yīng)，推測(cè)酯酶是小菜蛾對(duì)唑蟲酰胺解毒代謝的主要酶系，并且可能在小菜蛾對(duì)唑蟲酰胺的抗藥性進(jìn)化過程中具有極其重要的作用。此外，唑蟲酰胺LC30處理組的GSTs 酶活性波動(dòng)較大，其在藥后24 h 的GSTs 酶活性顯著高于LC50處理組，而在藥后48 和72 h 的GSTs 酶活性均顯著低于LC50處理組。這在一定程度上說明谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶可能不是小菜蛾幼蟲代謝唑蟲酰胺的主要因素，而是小菜蛾在不同程度脅迫下采取的一種生存對(duì)策。

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