抗蟲基因cry1Ab/Ac 在水稻雜交轉(zhuǎn)育后代中的表達(dá)效應(yīng)

楊 宙，康美花，劉建華，裴冬蓮，張標(biāo)金，張曉寧，曹豐生*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/水稻國家工程實驗室(南昌)，江西 南昌 330200;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200)

水稻是亞洲國家的主要糧食作物，對其造成危害的昆蟲超過200 種，其中的5 種主要害蟲分別是鱗翅目的螟蟲和同翅目的飛虱［1］。鱗翅目的主要害蟲是三化螟、二化螟和稻縱卷葉螟，每年都造成巨大的損失。在我國南方的雙季稻種植區(qū)，晚稻一般在7 月份移栽，其分蘗期和抽穗期適逢這3 種螟蟲發(fā)生的高峰，受到的危害更為嚴(yán)重。隨著植物基因工程的發(fā)展，許多Bt 基因被導(dǎo)入水稻中，成功地獲得了對這3 種螟蟲具有抗性的轉(zhuǎn)基因品系，并進(jìn)行了一些田間試驗和安全性評價。本研究中所轉(zhuǎn)育的cry1Ab/Ac 是一個融合的Bt 基因，已經(jīng)被證實能在水稻中高效地表達(dá)并發(fā)揮作用［2］。

原始的轉(zhuǎn)基因水稻材料農(nóng)藝性狀會受到影響，難以直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，需要通過常規(guī)育種方法將抗蟲基因?qū)朐耘嗥贩N中進(jìn)行改良，而抗蟲基因在這一過程中的遺傳和表達(dá)是實現(xiàn)育種目標(biāo)的重要因素。諸多研究表明，轉(zhuǎn)入水稻的外源基因能在雜交后代中穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)，為抗蟲基因的應(yīng)用提供了廣闊的前景［3-4］。外源基因轉(zhuǎn)入植物后，其表達(dá)必然要消耗物質(zhì)和能量，對植物其它性狀的表現(xiàn)產(chǎn)生不利的影響。外源基因的表達(dá)產(chǎn)物還可能有多效性，影響植物的結(jié)構(gòu)特點和代謝途徑［5-6］。有研究表明，將Bt 基因轉(zhuǎn)入棉花后，植株對鉀離子的吸收和轉(zhuǎn)運能力發(fā)生了改變［7］。目前還不能確定Bt 蛋白對水稻植株有負(fù)面影響，但Bt 水稻農(nóng)藝性狀的變異是普遍存在的，這些變異與Bt 基因表達(dá)水平之間的關(guān)系還有待闡明。

本研究以轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac 的秈稻品系TT51 為供體，與多個恢復(fù)系雜交。通過分子檢測和抗蟲性觀察，檢驗抗蟲基因在雜交后代中的遺傳規(guī)律。然后測定不同遺傳背景下的Bt 基因表達(dá)水平，分析其對抗蟲性和農(nóng)藝性狀的影響，旨在為利用雜交轉(zhuǎn)育培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的抗蟲水稻提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親本材料

雜交的父本轉(zhuǎn)基因品系TT51 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，是通過基因槍法將Bt 融合基因cry1Ab/Ac 導(dǎo)入秈稻恢復(fù)系明恢63 后得到的。母本材料有10 個，分別是廣恢998、先恢207、R163、R288、R451、G11012、G11112、G11553、G11796 和G11995。其中前5 個是目前國內(nèi)育成并廣泛應(yīng)用的恢復(fù)系，其余5個是本課題組育成的恢復(fù)系材料。

1.2 雜交與選擇

在水稻的抽穗開花期將母本植株上未授粉的穎花人工去雄，然后取父本的花粉授粉，套袋至成熟后收獲。PCR 分子檢測取水稻葉片，用CTAB 法抽提總DNA 作為模板，用針對cry1Ab/Ac 基因的特異引物擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為Cry1A-F 和Cry1A-R，引物序列以及反應(yīng)體系和程序參考相關(guān)的文獻(xiàn)［8］。擴(kuò)增片段為494 bp，通過8 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳分離，染色后在紫外光下觀察。

利用PCR 檢測在F1代去除假雜種，在F2代檢驗外源基因的分離比，每個F2代群體檢測40 個單株。選擇轉(zhuǎn)基因陽性的F2代單株收種，并自交加代。在F3代考察單株的抗蟲性，選擇農(nóng)藝性狀良好的抗性單株收種。在F4代篩選出10 種雜交組合的轉(zhuǎn)基因純合株系和對應(yīng)的陰性株系，用于Cry1Ab/Ac 蛋白含量的測定和后續(xù)的田間試驗。

1.3 Cry1Ab/Ac 蛋白含量測定

水稻中Cry1Ab/Ac 蛋白含量用上海佑隆生物科技有限公司的Cry1Ab/Ac 酶聯(lián)免疫定量檢測(ELISA)試劑盒測定。每個株系選4 個單株，在分蘗期取葉片，拔節(jié)期取莖稈。稱取約10 mg 樣品，用0.5 mL 的抽提液研磨成勻漿，靜置30 min 后吸取上清液，稀釋一定的倍數(shù)用于測定。ELISA 測定的操作過程參考說明書，反應(yīng)結(jié)束后用法國生物梅里埃公司的SH1000 型酶標(biāo)儀讀取450 nm 波長下的吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在上面讀出待測樣品的蛋白濃度，計算水稻組織的蛋白含量。不同株系的Cry1Ab/Ac 蛋白含量用成組數(shù)據(jù)的t 測驗進(jìn)行比較。

1.4 田間抗性評價

2013 年，筆者在位于南昌縣廣福鎮(zhèn)的轉(zhuǎn)基因試驗基地對轉(zhuǎn)基因水稻的抗蟲性進(jìn)行了評價。參試的水稻材料有12 個，分別是敏感對照明恢63、抗性對照TT51 以及10 個雜交組合的純合株系。水稻材料于5 月下旬播種，6 月下旬移栽。田間試驗按照隨機區(qū)組設(shè)計，3 個重復(fù)，每個小區(qū)種植兩行共20 單株。采用常規(guī)的水肥管理，不防治螟蟲，做自然發(fā)蟲處理。在水稻的分蘗盛期調(diào)查卷葉數(shù)，拔節(jié)期調(diào)查分蘗數(shù)和枯心數(shù)，計算枯心率。調(diào)查數(shù)據(jù)用SPSS12.0 軟件統(tǒng)計分析，通過LSD 法的t 測驗來檢驗各轉(zhuǎn)育株系與親本TT51 之間抗性差異的顯著性。

1.5 田間農(nóng)藝性狀考察

2013 年，筆者在轉(zhuǎn)基因試驗基地的其它田塊中對各水稻株系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了考察。參試的水稻材料有20 個，分別是10 個雜交組合的純合株系及對應(yīng)的陰性株系。田間試驗的設(shè)計與前面相同，不同的是每個小區(qū)的兩行中1 行為純合株系，另1 行為其對應(yīng)的陰性株系。采用常規(guī)的水肥管理，噴灑殺蟲劑，防治螟蟲危害。成熟后測量水稻的株高，然后收獲考察穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量。用成對數(shù)據(jù)的t 測驗來檢驗各純合株系相對其陰性株系農(nóng)藝性狀差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交轉(zhuǎn)育后代的檢測和篩選

在PCR 分子檢測中，F(xiàn)2代單株出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性和陰性兩種表型(圖1)。統(tǒng)計了10 個F2代群體中的陽性和陰性植株的數(shù)目，并對這兩種植株的總數(shù)進(jìn)行了分析，經(jīng)X2檢驗都符合3∶1 的比例，說明cry1Ab/Ac 基因在雜交轉(zhuǎn)育后代中是按照孟德爾規(guī)律遺傳的(表1)。

圖1 F2代植株的PCR 檢測Fig.1 PCR analysis of the F2plants

表1 cry1Ab/Ac 基因在F2代群體中的分離Tab.1 Segregation of cry1Ab/Ac gene in the F2populations

2.2 純合株系中的Cry1Ab/Ac 蛋白含量

Cry1Ab/Ac 蛋白在親本TT51 葉片中的濃度為17.0 μg/g 鮮質(zhì)量，在各轉(zhuǎn)育株系中為9.7～17.2 μg/g 鮮質(zhì)量，有6 個株系顯著降低。Cry1Ab/Ac 蛋白在TT51 莖稈中的濃度為3.02 μg/g 鮮質(zhì)量，在各轉(zhuǎn)育株系中為1.30～3.12 μg/g 鮮質(zhì)量，有4 個株系顯著降低(表2)。葉片與莖稈之間蛋白含量的相關(guān)系數(shù)為0.775，計算結(jié)果表明二者呈極顯著正相關(guān)。

表2 葉片和莖稈中的Cry1Ab/Ac 蛋白含量Tab.2 Concentration of Cry1Ab/Ac protein in leaf and stem

2.3 純合株系在田間的抗蟲性

在田間自然發(fā)蟲的條件下，敏感對照明恢63 單株卷葉數(shù)為5.43，枯心率為19.37%，受螟蟲危害較嚴(yán)重。抗性對照TT51 單株卷葉數(shù)僅為0.57，枯心率為2.27%，基本沒有受到蟲害的影響。7 個純合株系的抗蟲性表現(xiàn)與TT51 一樣，另外3 個株系的單株卷葉數(shù)和枯心率比TT51 極顯著地增加(表3)。但是與明恢63 相比，它們受害的程度仍然很輕微。

表3 純合株系所受的螟蟲危害Tab.3 Damage symptoms caused by pests on homozygous lines

2.4 純合株系的農(nóng)藝性狀

在防治螟蟲的處理下，所有的株系都沒有出現(xiàn)卷葉和枯心。經(jīng)過了3 代篩選，各株系的群體表現(xiàn)趨于一致和穩(wěn)定，農(nóng)藝性狀相對于親本TT51 都得到了一定程度的改良。其中G11012/TT51、G11553/TT51 和G11995/TT51 這3 個株系的結(jié)實率接近90%，R288/TT51、R451/TT51 和G11796/TT51 的單株產(chǎn)量接近或超過30 g，株葉形態(tài)優(yōu)良，展現(xiàn)出了較好的應(yīng)用潛力(表4)。

與對應(yīng)的陰性株系相比，大部分轉(zhuǎn)基因純合株系的農(nóng)藝性狀較差，株高變矮，產(chǎn)量降低。變異較為普遍的性狀是株高、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量，穗粒數(shù)和結(jié)實率的變異只發(fā)生在少數(shù)株系中。結(jié)合cry1Ab/Ac 基因的表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，蛋白含量較高的7 個株系中有6 個植株變矮，千粒質(zhì)量降低，5 個株系的單株產(chǎn)量顯著低于對應(yīng)的陰性株系。G11553/TT51、G11796/TT51 和G11995/TT51 這3 個蛋白含量較低的株系農(nóng)學(xué)性狀變異較少(表4)。這些結(jié)果表明cry1Ab/Ac 基因的表達(dá)對水稻的株高、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量有較大的影響。

表4 純合株系的農(nóng)藝性狀及其變異Tab.4 Agronomic traits and variations of homozygous lines

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因通過異常重組整合到水稻的基因組上，在部分家系中可能不按照孟德爾規(guī)律分離，甚至?xí)S著世代的增加而丟失［9］。TT51 是經(jīng)過篩選，被證明外源基因按照孟德爾規(guī)律遺傳的轉(zhuǎn)基因家系。10 個F2代群體中的陽性和陰性植株以及這兩種植株的總數(shù)按照3∶1 分離，說明cry1Ab/Ac 基因也能在這些雜交轉(zhuǎn)育后代中穩(wěn)定地遺傳，與其它類似研究的結(jié)論是一致的［10-11］。

Bt 基因在植物中的表達(dá)水平與多種因素有關(guān)，如載體的表達(dá)元件，轉(zhuǎn)基因插入位點，植物的遺傳背景、組織器官和發(fā)育階段等［12］。本研究中各株系葉片和莖稈中cry1Ab/Ac 基因表達(dá)水平差異很大，前者的蛋白含量是后者的5 倍左右，這主要是由葉片和莖稈不同的組織結(jié)構(gòu)和生理功能引起的。取樣是在水稻的營養(yǎng)生長期，葉片作為主要的光合作用器官，蛋白質(zhì)合成旺盛并迅速積累。而莖稈主要由輸導(dǎo)組織和機械組織構(gòu)成，負(fù)責(zé)物質(zhì)的運輸和支撐水稻結(jié)構(gòu)，Bt 蛋白難以在其中形成較高的濃度。株系之間cry1Ab/Ac 基因表達(dá)水平差異也較大，多個轉(zhuǎn)育后代的葉片和莖稈Bt 蛋白含量與親本TT51 相比顯著降低，最多的相差2 倍以上。各株系的Bt 基因表達(dá)元件和插入位點，以及取樣的組織和時期都相同，因此表達(dá)水平的差異應(yīng)該歸結(jié)于遺傳背景的不同。Bt 基因表達(dá)水平除受植物物種影響外，在相同物種的不同品種間也會存在差異［13］。這里Cry1Ab/Ac 蛋白含量極顯著降低的株系是G11553/TT51、G11796/TT51 和G11995/TT51，其中的母本G11553 帶有部分粳稻血緣，G11796 和G11995 帶有部分野生稻血緣。因此，筆者推測雙親之間遺傳背景差異較大會抑制Bt 基因在雜交后代中的表達(dá)。

cry1Ab/Ac 基因編碼的是Cry1A 類的蛋白，對鱗翅目昆蟲的毒性很強，已經(jīng)在多種商業(yè)化種植的作物中發(fā)揮作用。部分株系的Cry1Ab/Ac 蛋白含量顯著降低，葉片中最低為8.3 μg/g，莖稈中最低為1.3 μg/g。但是出現(xiàn)的枯心和卷葉很少，產(chǎn)量的損失幾乎可以忽略。這說明較低的Cry1Ab/Ac 濃度仍然能夠有效地防治螟蟲，對轉(zhuǎn)基因家系的選擇可以在更寬的Bt 蛋白濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。

轉(zhuǎn)基因純合株系和陰性株系的遺傳背景基本相同，主要的差別在于轉(zhuǎn)基因插入位點上。cry1Ab/Ac基因的插入并沒有引起水稻內(nèi)源功能基因的失活，而轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生的體細(xì)胞變異在陽性和陰性株系中共同存在，所以二者農(nóng)藝性狀之間的差異主要歸因于cry1Ab/Ac 基因的表達(dá)。結(jié)合表2 和表4 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白含量較高的株系株高和千粒質(zhì)量的變異較大，并最終影響了產(chǎn)量。因此，在滿足抗性所需Bt 蛋白濃度的前提下，可以注重對農(nóng)藝性狀的考察，選擇蛋白濃度適量且性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因株系作為育種的親本。本研究中轉(zhuǎn)育得到的部分株系抗蟲性良好，農(nóng)藝性狀變異小，在水稻育種中具有廣泛應(yīng)用的潛力。

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