漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)診斷中傳統(tǒng)涂片法和細(xì)胞塊法的應(yīng)用價(jià)值比較

劉 艷，郝大海

(安徽省阜陽市腫瘤醫(yī)院病理科，安徽阜陽 236018)

漿膜腔積液標(biāo)本是病理科或細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)送檢標(biāo)本，也是分析、診斷疾病的重要依據(jù)。常規(guī)離心涂片檢查以其簡單，快速，費(fèi)用低等特點(diǎn)已成為臨床診斷良惡性積液常用及重要的方法。近年來細(xì)胞塊法也不斷被應(yīng)用于日常工作中。為了比較傳統(tǒng)涂片法同細(xì)胞塊法的優(yōu)劣，我們收集了165例漿膜腔積液，涂片同時(shí)制作細(xì)胞塊，必要時(shí)輔以免疫組化染色，進(jìn)行診斷。

1 資料與方法

1.1 資料 收集我科2011年1月—2013年7月漿膜腔積液2100例，經(jīng)確診病例165例，不確定病例及未能做細(xì)胞塊者未列入此組，在涂片同時(shí)制作細(xì)胞塊做石蠟切片。該組病例男性70例，女性95例，年齡21～87歲，胸水87例，腹水69例，其他部位穿刺液9例。

1.2 試劑 所用甲醛及95%乙醇均為分析純，免疫組化試劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，抗體和試劑均為即用型S-P試劑盒及酶底物顯色劑DAB試劑盒，按說明書的實(shí)驗(yàn)步驟操作。

1.3 方法 送檢積液標(biāo)本一般約500 mL左右，將標(biāo)本室溫靜置30 min，輕輕棄去上清液，留取50～100 mL下層液體，如為血性保本，可以在下層液體加入10%福爾馬林300 mL左右，搖勻后使紅細(xì)胞溶解破壞，室溫再靜置30 min，棄去上清液，同樣留取下層液體，如紅細(xì)胞過多，可反復(fù)2～3次，使紅細(xì)胞全部破壞，然后取下層沉淀物兩管配平2 000 r·min－1，離心5 min，輕輕取出離心管，棄去上清液，其中一管沉渣用棉簽沾取涂片2張，另一管加95%酒精3～5 mL搖勻后，2 000 r·min－1，離心 5 min，取沉渣用濾紙包好，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，包埋，切片及染色，光鏡觀察診斷，必要時(shí)進(jìn)一步做免疫組化染色標(biāo)記。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) (1)傳統(tǒng)涂片法:涂片法鏡下肯定惡性特征的細(xì)胞定為惡性(陽性)，再根據(jù)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行傾向性分型。細(xì)胞有惡性特征，但證據(jù)不足，定為疑癌細(xì)胞(陽性);細(xì)胞有異型，但與增生的間皮無法鑒別定為異型細(xì)胞(陰性);未見惡性細(xì)胞或異型細(xì)胞定為陰性。(2)細(xì)胞塊:細(xì)胞塊法切片鏡下有惡性細(xì)胞，具有腺性特征診斷為腺癌，具有鱗狀細(xì)胞特征者診斷為鱗癌;不能分型者免疫組化染色進(jìn)一步鑒別。(3)免疫組化:免疫組化染色是10%以上的靶細(xì)胞出現(xiàn)定位清晰的棕褐/黃色顆粒為陽性表達(dá)(按抗體說明書上的有效著色部位)，目標(biāo)靶細(xì)胞完全不著色為陰性，介于二者之間為弱陽性(不確定表達(dá))。(4)臨床確診(綜合診斷):臨床及影像學(xué)+病理診斷為惡性或臨床及影像學(xué)+腫瘤標(biāo)志物+涂片或切片見到惡性腫瘤細(xì)胞為陽性病例;涂片或切片均未見惡性腫瘤細(xì)胞+積液臨床檢驗(yàn)及治療反應(yīng)均提示非腫瘤性積液為陰性病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 兩種方法檢測結(jié)果同臨床確診的符合情況分析:采用配對設(shè)計(jì)定性資料的McNemar χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 取0.05。

2 結(jié)果

165例漿膜腔積液傳統(tǒng)涂片法與細(xì)胞塊法良惡性分類具體結(jié)果見表1所示。8例兩種方法均未能分型，后經(jīng)免疫組化分型確診為，低分化腺癌4例，鱗癌1例，淋巴瘤1例，精原細(xì)胞瘤1例，未確定1例。表2顯示傳統(tǒng)涂片法、細(xì)胞塊法檢測結(jié)果及臨床確診情況。傳統(tǒng)涂片法的診斷敏感性、特異性及準(zhǔn)確率分別為84.5%、90.3%及86.7%，而細(xì)胞塊法的診斷敏感性、特異性及準(zhǔn)確率分別為89.3%、100%及93.3%。表3顯示兩種方法同臨床確診的符合情況，兩種方法檢測結(jié)果之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞塊法優(yōu)于傳統(tǒng)涂片法。

表1 傳統(tǒng)涂片法及細(xì)胞塊法檢測結(jié)果

癌細(xì)胞胞體及胞核較大，明顯異型，多形性，染色質(zhì)較粗，深染，呈團(tuán)狀，條索狀排列，與間皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞相比具有另類的特征，腺癌細(xì)胞常成團(tuán)或散在分布，細(xì)胞圓形或橢圓形，核大畸形深染，核漿比例高，核仁明顯，易見胞漿空泡，排列成梅花狀，腺腔樣，乳頭狀等(圖1);而鱗狀細(xì)胞癌在積液中常散在或小簇分布，圓形，梭形或不規(guī)則形，核染色質(zhì)深，似碳墨狀，有時(shí)可見細(xì)胞間橋及角化(圖4);腺癌的惡性細(xì)胞在細(xì)胞塊中排列成腺管狀，乳頭狀等腺樣結(jié)構(gòu)(圖2，3)，鱗癌細(xì)胞排列成片狀，可見明顯細(xì)胞間橋或角化的鱗狀細(xì)胞特征(圖5);但是，一些乳腺浸潤性導(dǎo)管癌細(xì)胞在胸水中是成團(tuán)分布，在細(xì)胞塊中可類似鱗狀細(xì)胞癌的排列(圖6)，但仔細(xì)辨認(rèn)，可以發(fā)現(xiàn)浸潤性導(dǎo)管癌在細(xì)胞塊中是一圈一圈的規(guī)則排列，并沒有鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞間橋，另外鱗狀細(xì)胞癌一般表達(dá)高分子量CK，而乳腺癌往往表達(dá)低分子量CK，ER，PR ，C-ERB-b2等。

表2 傳統(tǒng)涂片法、細(xì)胞塊法檢測結(jié)果及臨床確診情況(二分類)

表3 傳統(tǒng)涂片法、細(xì)胞塊法與臨床確診的符合情況

注:圖1，細(xì)胞涂片顯示腺癌細(xì)胞成團(tuán)分布，立體感較強(qiáng);圖2，3，細(xì)胞塊切片示腺癌排列成腺管狀，菊團(tuán)狀等腺樣結(jié)構(gòu)。圖4，示涂片中的鱗狀細(xì)胞癌散在分布，圓形或不規(guī)則形，核染色質(zhì)深;圖5，示細(xì)胞塊切片中的鱗狀細(xì)胞癌排列成片狀，見明顯細(xì)胞間橋;圖6，細(xì)胞塊切片顯示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的環(huán)狀排列。HE×200。

3 討論

漿膜腔積液常是某些疾病的并發(fā)癥，有時(shí)甚至是唯一的臨床表現(xiàn)。引起漿膜腔積液的病變主要有良性病變(如:炎癥，外傷，結(jié)締組織病等)和惡性腫瘤(最常見的是轉(zhuǎn)移性腺癌)，對漿膜腔積液的病因判斷最具有意義的是確定到底是炎癥還是腫瘤，多數(shù)病例憑傳統(tǒng)涂片常規(guī)染色能判斷良惡性，但缺乏客觀指標(biāo)，其次直接涂片法由于制片及細(xì)胞本身分布情況限制，對于腫瘤的分型卻不太理想，還可能因?yàn)闃?biāo)本少，含血，膠凍狀標(biāo)本導(dǎo)致細(xì)胞少或細(xì)胞變形影響診斷而誤診，并且漿膜腔積液是一種良好的培養(yǎng)基，腫瘤細(xì)胞脫落到積液中可以形成與腫瘤原發(fā)灶不同的細(xì)胞形態(tài)，腫瘤細(xì)胞形態(tài)的多樣性及其形態(tài)學(xué)改變的不一致性往往令人真假難辨［1］;該組病例中傳統(tǒng)涂片法1例陰性，后經(jīng)細(xì)胞塊及臨床和組織學(xué)確定為惡性，考慮為涂片細(xì)胞較少漏診所致，因此，僅憑常規(guī)涂片鏡下結(jié)果選擇治療方案風(fēng)險(xiǎn)過高。

正常成熟的間皮細(xì)胞為圓形或卵圓形，胞漿淡染，核居中染色質(zhì)纖細(xì)，分布均勻，但在慢性炎癥、放療化療及腫瘤的刺激下間皮細(xì)胞增生旺盛，增生活躍的細(xì)胞表現(xiàn)較幼稚，或間皮細(xì)胞出現(xiàn)退化現(xiàn)象。細(xì)胞呈現(xiàn)一定的異形性，核略增大，可呈假腺腔樣或桑葚狀排列，間皮細(xì)胞變化多端，增生活躍的間皮細(xì)胞或反應(yīng)性異形增生的間皮細(xì)胞與癌細(xì)胞辨別是漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)診斷難點(diǎn)之一，有時(shí)散在或小片狀分布的鱗狀細(xì)胞癌在積液中會形成圓形細(xì)胞，失去了鱗狀細(xì)胞癌的梭形，不規(guī)則形等多形性，加之積液中的細(xì)胞易出現(xiàn)空泡變性常誤認(rèn)為退變的間皮細(xì)胞，這時(shí)間皮細(xì)胞與癌細(xì)胞較難鑒別。細(xì)胞塊石蠟切片可以彌補(bǔ)涂片這方面的不足，該方法可以收集到的有核細(xì)胞多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，并能保持一定的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和排列方式，有利于常規(guī)病理學(xué)診斷［2］。對于血性漿膜腔積液經(jīng)過溶解紅細(xì)胞處理，紅細(xì)胞消失了，而有核細(xì)胞保存完整不變形，染色質(zhì)清晰可辯，尚存成團(tuán)，成堆腫瘤細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)，在切片中顯示細(xì)胞的微粒組織結(jié)構(gòu);與常規(guī)涂片法相結(jié)合，大大提高了細(xì)胞學(xué)的陽性檢出率［3］。惡性積液97%左右為轉(zhuǎn)移癌，而轉(zhuǎn)移癌中腺癌占95%［1］，所以首先把轉(zhuǎn)移性腺癌鑒別出來，具有很重要的意義，其余3%為原發(fā)于間皮的腫瘤(間皮瘤)，間皮瘤細(xì)胞在積液中散在分布，細(xì)胞分界清楚，有單核，雙核及瘤巨細(xì)胞，核常居中，與正常或變性的間皮細(xì)胞極易混淆，容易漏診;有時(shí)間皮瘤細(xì)胞亦可鑲嵌，成團(tuán)排列，與轉(zhuǎn)移性腺癌類似，難以鑒別［4－5］，此時(shí)可以借助細(xì)胞塊免疫組化染色加以區(qū)分，有些漿膜腔積液瘤細(xì)胞較少或細(xì)胞有些異型，但不夠典型，涂片很難診斷，只能報(bào)告為疑癌細(xì)胞或異型細(xì)胞，正確區(qū)分或判別這些細(xì)胞的性質(zhì)和類型，可以給患者帶來最佳治療時(shí)機(jī)，也是給臨床醫(yī)師一個(gè)信息。本組26例不確定病例(11例疑癌和15例異型細(xì)胞)經(jīng)細(xì)胞塊也都得到了明確診斷，把增生的間皮細(xì)胞和反應(yīng)性增生的細(xì)胞與惡性癌細(xì)胞鑒別開來，增生的間皮細(xì)胞在細(xì)胞塊中是松散排列或流水樣平鋪排列，細(xì)胞邊緣不整齊，沒有癌細(xì)胞的緊密結(jié)構(gòu)，細(xì)胞染色質(zhì)細(xì)膩均勻。而真正的惡性細(xì)胞?？梢姷较偾粯?，乳頭狀，或緊密的片狀排列，細(xì)胞染色質(zhì)較粗，顆粒狀或團(tuán)塊狀，異型明顯，常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片結(jié)合細(xì)胞塊切片能夠顯示細(xì)胞排列方式及組織結(jié)構(gòu)，使這部分細(xì)胞能夠明確分類，給患者治療提供一個(gè)正確的方向，1例細(xì)胞塊未確定診斷患者曾轉(zhuǎn)安徽省立醫(yī)院治療，患者2周內(nèi)死亡。結(jié)合臨床及免疫組化為臨床查找原發(fā)灶提供客觀依據(jù)。其次，細(xì)胞塊石蠟切片免疫組化染色是鑒別漿膜腔積液中異型細(xì)胞良惡性及惡性細(xì)胞組織來源的理想方法［6－7］。增生的間皮細(xì)胞在免疫組化中表達(dá)calretinin，mesothelial，vimtin，一般不表達(dá)CEA，EMA以及一些組織相對特異性標(biāo)志物，如細(xì)胞表達(dá)TTF-1高度提示腫瘤來源于肺或甲狀腺，表達(dá)CEA，CK20，提示腫瘤來自消化道，表達(dá)CK7，CA125可能來源于子宮附件，其對于傳統(tǒng)涂片不僅提高了陽性檢出率，而且明確了組織來源［8－9］。另外，細(xì)胞塊對不能切除腫瘤的病人提供了可永久保存的保本，可應(yīng)用于分子病理診斷，為惡性腫瘤患者提供了一種行之有效的組織學(xué)分型和基因檢測途徑，為惡性腫瘤晚期和需靶向治療的患者提供了可靠的分子病理診斷依據(jù)［10］，以指導(dǎo)分子靶向藥物的篩選，為這類患者提供一種臨床治療手段。對于一些復(fù)發(fā)腫瘤引起的積液，可以通過細(xì)胞塊免疫組化標(biāo)記來對比腫瘤的免疫表型有無改變，給臨床治療提供新思路。傳統(tǒng)涂片利于觀察細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的整體輪廓，細(xì)胞塊切片可顯示細(xì)胞群團(tuán)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)［11］細(xì)胞塊石蠟切片與傳統(tǒng)涂片相結(jié)合的方法，架起了細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)之間溝通的橋梁，為細(xì)胞學(xué)的正確診斷提供有力保障。

［1］ 馬博文.漿膜腔積液細(xì)胞病理學(xué)診斷［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2006:1－12.

［2］ Shivakumarswamy U，Arakeri SU，Karigowdar MH，et al.Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology［J］.J Cytol，2012，29(1):11 －15.

［3］ 孫亞軍，李 梅，吳建農(nóng)，等.細(xì)胞塊技術(shù)聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)檢測漿膜腔積液中腺癌細(xì)胞的價(jià)值［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2013，20(9):933－935.

［4］ 王紅群，李道旺.腹膜惡性間皮瘤1例伴文獻(xiàn)復(fù)習(xí)［J］.安徽醫(yī)藥，2012，16(9):1284.

［5］ 沈 勤，王國慶，張麗華.卵巢纖維瘤合并腹膜惡性間皮瘤臨床病理觀察［J］.診斷病理學(xué)雜志，2011，9(1):46 －48.

［6］ 劉 巖，徐美林，王 菁，等.端粒酶活性和免疫細(xì)胞化學(xué)在腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用［J］.中華病理學(xué)雜志，2012，41(3):184.

［7］ 羅巧明 ，江鶴靈，張 建.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢查協(xié)助鑒別漿膜腔積液中轉(zhuǎn)移性腺癌原發(fā)部位［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，2(4):823－824.

［8］ 高福平，魏 謹(jǐn)，孫國平.CEA、Calretinin在良惡性胸水細(xì)胞塊中的診斷價(jià)值［J］.臨床肺科雜志，2011，7(11):2052.

［9］ 張衛(wèi)琴.免疫組化技術(shù)在病理診斷中的應(yīng)用［J］.安徽醫(yī)藥，2012，16(11):1700 －1701.

［10］ 張 纓，周 瑜，梅 佳，等.惡性漿膜腔積液細(xì)胞塊在分子病理診斷中的應(yīng)用［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2013，18(2):147 －150.

［11］ 毛瑛玉，楊 敏，劉冬戈，等.細(xì)胞塊切片免疫細(xì)胞化學(xué)染色在漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用［J］.中華病理學(xué)雜志，2009，38(8):548.