G-CSF動員的HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療治療惡性血液病安全性觀察

牛 伶，李 坦，汪 毅，劉媛媛，鮑揚漪

(安徽省合肥市第一人民醫(yī)院血液科，安徽合肥 230061)

對于急性白血病及高危組骨髓增生異常綜合癥患者，單純性化療及自體干細胞移植可提高生存率，但復發(fā)率相對較高［1－2］;異基因造血干細胞移植減少了復發(fā)風險，但移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生率及移植相關死亡率高且費用昂貴［3］。目前郭梅等［4］報道顯示活化HLA錯配的外周血造血干細胞(HLA-mismatched peripheral blood stem cells;Mismatched-BPSC)輸注聯(lián)合化療治療老年白血病與單純化療的對照組相比顯著提高了緩解率與生存率，部分有微崁合，均無GVHD。國外也有數(shù)個小樣本的臨床研究嘗試對非移植的難治性、復發(fā)性惡性血液病患者給予供者白細胞輸注治療，其方案多樣，有供者動員與非動員、輸注前給予患者小劑量全身照射預處理與非照射的、HLA相合與錯配的等等，取得了一定的療效，其療效與植入與否不一致［5－7］。

我科于2012年始對10例惡性血液病患者給予G-CSF動員的HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療，現(xiàn)將其安全性報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集 2012年1月至2013年9月10例在我院接受Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療治療的惡性血液病患者，所有患者均為初治或復發(fā)難治惡性血液系統(tǒng)疾病，無HLA相合的供者或因各種原因拒絕行經(jīng)典造血干細胞移植、PS≤2分;同時未接受過自體或異體干細胞移植、全身照射及氟達拉濱、阿侖單抗等藥物治療;女3例，男7例，年齡28～81歲，中位年齡49歲。按2008年WHO分類、2009NCCN急性髓系白血病(AML)危險度及骨髓增生異常綜合征(MDS)國際預后積分系統(tǒng)分組(表1)。所有參與臨床試驗患者均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準。

表1 入組患者基礎情況及化療方案

1.2 主要試劑 重組人G-CSF為麒麟鯤鵬(中國)生物藥業(yè)有限公司生產，GT-T552無血清培養(yǎng)基為日本Takara生物公司生產，細胞因子檢測ELISA試劑盒、LDH殺傷檢測試劑盒為碧云天生物公司產品，免疫細胞表型鑒定熒光標記抗體均為美國BD Bioseience公司產品。

1.3 HLA高分辨配型、嵌合監(jiān)測 化療前入選患者及供者均經(jīng)實驗室行HLA配型。通過聚合酶鏈反應-測序分型(polymerase chain reaction sequencebased typing，PCR-SBT)對 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1 進行高分辨分型:首先進行位點特異性PCR擴增，以產物作為模板行測序反應。測序反應產物經(jīng)純化及變性后電泳，結果由ASSIGN軟件(CONEXIO)進行HLA等位基因的分析確認。HLA-Mismatched-BPSC回輸后第7天、第14天采用STR-PCR和毛細管電泳片段分析方法對供、受者進行16個STR位點基因型檢測并計算嵌合率。

1.4 外周干細胞動員、采集、相關檢測及回輸HLA-Mismatched-BPSC采自患者健康的直系親屬，采集前供者接受重組人粒細胞集落刺激因子(GCSF)10 μg·kg－1·d－1×5 d，使用費森尤斯卡比血細胞分離機進行外周血干細胞采集，共采集兩次。并對外周血干細胞行單核和細胞、CD34+細胞、CD3+細胞進行計數(shù)。除首次回輸?shù)母杉毎?，將采集的剩余細胞置于?96℃液氮中凍存。

1.5 治療方案 所有患者均未接受免疫抑制處理，HLA-Mismatched-BPSC均在化療結束24～48 h內輸注;首次化療結束后即第一次回輸?shù)腍LA-Mismatched-BPSC為新鮮的外周造血干細胞，此后每次配伍化療回輸則為首次采集后凍存的外周血干細胞?；颊哂诨剌斍翱诜麃砦舨寂c地塞米松，本試驗中患者接受3次HLA-Mismatched-BPSC回輸(圖1)。如患者接受化療后粒細胞低于0.5×109·L－1，則予以重組人粒細胞刺激因子 300 μg·d－1，直至患者粒細胞恢復至正常值。

圖1 治療路線及相關指標檢測路線圖

1.6 血象恢復時間及不良反應觀察 根據(jù)張之南《血液病診斷及療效標準》對患者進行評價;血象恢復時間:中性粒細胞 ＞0.5 ×109·L－1連續(xù)3 d、血小板＞30×109·L－1連續(xù)3 d。不良反應的評價按照美國國立癌癥研究所/NCI《常見不良事件評價標準》(Common terminology criteria for adverse events，CTCAE version 4.0)進行安全評估，分為 I～V級5個級別，Ⅲ～V級不良反應視為嚴重不良反應。

2 結果

2.1 HLA配型、嵌合度監(jiān)測 10對供受者均為HLA單倍相合:其中6對供受者在HLA-A/-B/-DR6個位點中有3個位點相合，4對有4個位點相合。例6患者在回輸后第7、10天檢測出20%嵌合，第14天嵌合檢測為0%;其余9例未檢測出嵌合。

2.2 HLA-Mismatched-BPSC的采集和回輸 經(jīng)治患者進行化療的同時接受HLA-Mismatched-BPSC回輸3次，平均每次回輸給患者CD34+細胞為(0.9～10.2)×106·kg－1;單個核細胞數(shù)量為(1.6 ～8.9)×108·kg－1;CD3+細胞數(shù)量為(0.22 ～2.4)×108·kg－1(表2)。

表2 平均回輸?shù)膯魏撕图毎D34+細胞、CD3+細胞進行計數(shù)

2.3 不良反應 10例患者在化療聯(lián)合干細胞輸注治療后24 h內均出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，最高可達39.4℃，予以抗感染及激素治療后24 h內體溫恢復正常，維持3 d以上。所有經(jīng)治患者均未見肝損、出血、腹瀉、水腫等GVHD發(fā)生。其中5例患者接受細胞輸注時 CD3+T 細胞≥1.5 ×108·kg－1，在接收細胞輸注后24 h內胸、腹部及四肢出現(xiàn)皮疹，采用對癥治療后2 d內迅速緩解。

2.4 患者行HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療與自身僅化療時血象恢復時間對比 本次入組患者有4例可進行自身對比，見表3。

表3 患者血象恢復時間對比

2.5 療效評價 5例外周血干細胞輸注聯(lián)合化療初治患者均完全緩解，隨訪時間3～22個月。3例外周血干細胞輸注聯(lián)合化療鞏固患者均完全緩解，目前隨訪6～34個月。2例外周血干細胞輸注聯(lián)合化療復發(fā)患者，1例髓外復發(fā)病灶短暫消失，此后失訪，1例未緩解。

3 討論

目前比較一致的觀點認為異基因移植患者的免疫抑制及輸注的干細胞數(shù)量是確保移植物植入及誘發(fā)GVHD重要原因。有報道對13例難治性實體腫瘤及12難治性惡性血液病行100 cGy的全身照射及非動員異基因淋巴細胞輸注治療。其中實體腫瘤患者6例接受臍血輸注，7例接受同胞淋巴細胞輸注;血液病患者1例接受臍血輸注，11例接受同胞淋巴細胞輸注;18例同胞供受者之間，17例為全相合，1例為5/6匹配。實體腫瘤患者本方法治療前未接受高強度化療，而惡性血液病患者治療前均不同程度接受含免疫抑制劑的高強度化療。實體腫瘤患者均為檢測出嵌合。惡性血液病患者9例發(fā)生嵌合。范圍從5%到100%，其中5例發(fā)生GVHD［5］。Colvin等報道對15例性實體腫瘤及26難治性惡性血液病行100 cGy的全身照射及半相合異基因外周干細胞輸注治療。29患者接受至少1×108·kg－1CD3+細胞輸注，其中10例檢測出短暫嵌合，有兩例達100%嵌合，其中1死于GVHD;另外12接受較低劑量 CD3+細胞輸注者未檢測出嵌合［6］。提示嵌合與否決定于免疫抑制的程度及輸注的干細胞數(shù)量。Strair等報道了16例自體造血干細胞移植患者接受異基因淋巴細胞輸注，有4例發(fā)生GVHD，其在淋巴細胞輸注前曾接受免疫抑制治療;而其余未接受免疫抑制治療12例患者，無此現(xiàn)象發(fā)生［8］。本研究中僅1例發(fā)生短暫嵌合，其余9例未觀測到嵌合發(fā)生，本試驗中所有患者在化療配伍干細胞輸注前均未接受過免疫抑制治療，故推測因保留了自身的免疫功能，從而排斥移植物的植入因而未能發(fā)生嵌合;沒有一例發(fā)生GVHD也可說明這一點。其中1例患者輸注的較大劑量的CD34+細胞，而出現(xiàn)短暫嵌合，提示輸注的干細胞數(shù)量對移植物的植入起一定作用。國內有報道101例大劑量化療聯(lián)合體外處理的干細胞輸注治療急性白血病，4例發(fā)生短暫嵌合，無1例發(fā)生GVHD也證明了以上推測，該報道對23例患者進行微嵌合檢測，其中20例陽性［9］;而本實驗中是未經(jīng)處理的干細胞直接輸注，且未行微嵌合檢測，故是否存在微嵌合有待進一步檢測及研究。另一種可能是由于輸注的細胞包含有造血干細胞、祖細胞、NK細胞，其能調節(jié)TH1/TH2細胞平衡，而防止GVHD發(fā)生。

目前有研究表明對難治性惡性血液病患者進行HLA-Mismatched-BPSC輸注，CD3+細胞輸注量不少于1×108·kg－1的患者在輸注后出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、腹瀉及水腫等不良反應，同時檢測到輸注后IL-5、IL-6、IL-8 、IL-10、IFN-γ 等細胞因子明顯增高;患者出現(xiàn)的相關癥狀與體征考慮與外周血干細胞輸注后患者機體釋放各種細胞因子引起［6］。本研究中患者無論輸注的CD3+細胞量多少，接受治療后均出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象在予以包含激素的治療后短時間內恢復正常，且維持3 d天以上，皮疹在激素治療后迅速緩解，也提示這種類過敏現(xiàn)象的發(fā)生可能為機體釋放各種細胞因子引起——即所謂的細胞因子風暴(cytokine storm)。值得注意的是，本實驗中患者輸注的HLA-Mismatched-BPSC是一群異質細胞，其中患者每次接受的干細胞中含有較多的CD3+T細胞，且其中含有一定數(shù)量的NK細胞，異體T、NK細胞注入，可能是造成患者輸注后發(fā)熱、皮疹等應激反應的原因。根據(jù)John L Reagan［10］的試驗結果，這種過敏反應的發(fā)生往往預示著較好的應答率與治療預期。

郭梅等［9］報道了101例大劑量化療聯(lián)合體外處理的干細胞輸注治療急性白血病的文章中，發(fā)生微嵌合的患者其血細胞恢復時間較單純化療對照組有所縮短。在本研究中HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合化療相對單純化療，患者血細胞恢復時間有縮短傾向，與上述報道一致;推測這是由于輸注的細胞包含有造血干細胞、祖細胞，其能促進患者造血恢復;另一個可能即輸注的干細胞與G-CSF共同促進了患者造血恢復，其機制有待進一步研究。

報道［6］顯示對26例難治惡性血液病患者進行異基因血細胞輸注，部分患者可重新獲得緩解，其推測是由于外周血干細胞輸注打破了患者對腫瘤細胞的免疫耐受，激活了患者免疫系統(tǒng)起到抗腫瘤作用，而非移植物抗腫瘤效應。本研究中8例為完全緩解，1例髓外復發(fā)患者病灶有短暫的消失。干細胞輸注后9例無嵌合發(fā)生，故可排除移植物抗白血病效應;由于本研究為HLA-Mismatched-BPSC輸注聯(lián)合了化療，缺乏僅化療患者對照組、隨訪時間較短，HLA-Mismatched-BPSC輸注是否具有非特異性抗腫瘤作用和其對長期生存時間的影響有待進一步對比與跟蹤。

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