茶多酚對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷的腦保護作用

朱振丹，茆 翔，劉佰運，3，4

(1.安徽醫(yī)科大學武警總醫(yī)院臨床學院;2.武警總醫(yī)院神經創(chuàng)傷外科，北京 100039;3.北京市神經外科研究所;4.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050)

目前創(chuàng)傷性顱腦損傷已經嚴重威脅到人類生存健康，據報道在人類各種創(chuàng)傷疾病中，顱腦創(chuàng)傷的發(fā)病率占第2位，死亡率占第1位，治療起來非常棘手，在美國每年約有1 700 000人會發(fā)生顱腦創(chuàng)傷［1］。在國內可能由于統(tǒng)計樣本量以及治療條件所限，每年大約有60萬人發(fā)生創(chuàng)傷性顱腦損傷，在這其中死亡人數(shù)約在10萬人左右，造成的經濟損失達100億元以上，部分幸存者往往伴有短期或長期認知功能障礙，創(chuàng)傷性顱腦損傷的發(fā)生機制復雜，已經有報道稱高壓氧能通過提高動脈血氧分壓，氧彌散率及有效彌散距離來改善腦組織的用氧代謝，減少腦水腫［2］，另外氧化應激損傷被認為是導致創(chuàng)傷性腦水腫的重要機制。

茶多酚(Tea Polyphenols)是茶葉中酚類及其衍生物的總稱，是茶葉中的主要活性成分，茶多酚的主要組分是黃烷醇類、花色苷類、黃酮醇類和黃酮類等。由于具有2-苯基苯并呲喃的基本結構，故統(tǒng)稱為黃酮類物質，茶多酚因含酚性羥基故極易發(fā)生氧化、聚合、縮合等變化，具有較好的抗氧化、清除自由基的能力，它是目前報道的抗氧化作用最強的藥物之一。茶多酚應用廣泛，據文獻報道茶多酚被應用于對皮膚的保護［3］，茶多酚可以有效地抑制環(huán)境誘導的乳腺癌［4］，抑制自身免疫性疾?。?］。

由于在顱腦創(chuàng)傷后所致的腦水腫中，氧化應激被認為是其中重要的機制之一，結合茶多酚的抗氧化作用，本實驗擬探討茶多酚在顱腦外傷中的腦保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 茶多酚購于 Sigma公司，美國，批號E4143。實驗動物:選用成年健康雄性SD大鼠，體重為(300±30)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號［SCXK(京)2012－0001］。

1.2 實驗分組 本實驗分為三組:對照組(n=32)、模型組(n=32)和給藥組(n=32)。給藥組大鼠腹腔注射茶多酚(200 mg·kg－1)，模型組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水，注射時間為打擊后30 min，各組動物均于24 h后采用過量麻醉的方式(800 mg·kg－1)斷頭處死。

1.3 動物模型的建立 SD大鼠采用10%水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔注射麻醉。采用無菌操作程序，在不損毀硬腦膜的情況下手術小心地移去頭顱帽，將大鼠放置于立體定位架內。打擊頭垂直于暴露的皮層表面。實驗中打擊器參數(shù)設置為:接觸速率設置為2.0 m·s－1，打擊深度設置為2.5 mm，停留時間設置為85 ms。在實驗期間大鼠的核心體溫保持在36～37℃。模型組和給藥組均采用上述方法進行去骨瓣打擊，而對照組僅開骨窗去除骨瓣而不打擊。

1.4 神經功能缺損評分 神經功能缺損評分從感覺實驗、橫梁平衡實驗、反射實驗等方面對動物進行神經功能缺損評分，最高18分，分數(shù)越高表示神經功能缺損程度越重，對各組實驗動物在打擊24 h后進行神經功能缺損評分，各組于同等時間進行評分，采用雙盲法進行。

1.5 腦含水量的測定 采用干濕重法測腦組織含水量，于打擊24 h后，每組8只大鼠，過量麻醉后立即斷頭取腦切成左右兩半，用電子天平稱取病灶側半球的重量，然后置于100℃烤箱內烤24 h，用同一天平再次稱重，以［(濕重)干重)/濕重×100%］即為相對含水量。

1.6 BBB通透性測定 本實驗用伊文氏藍(evens blue，EB)測定BBB通透性。大鼠處死前2 h，自股靜脈注入2%EB溶液(20 mg·kg－1)，接下來的2 h用于平衡。大鼠腦組織取出后加甲酰胺溶液3 mL，之后加蓋避光并于54℃水浴箱中提取1 d，在紫外分光光度計下測量提取液的光密度值(OD值)，使用分光光度計(620～680 nm)測得其吸光度，計算腦組織中EB含量。

1.7 Western blot檢測水腫相關蛋白 AQP4、MMP-9的表達情況 裂解的蛋白于100℃水浴10 min后，上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，80 V、30 min 和 100 V、90 min 后，經 200 mA、120 min 將蛋白從膠上轉印到孔徑 0.2 μmol·L－1的硝酸纖維素膜上。將該膜浸于含50 g·L－1脫脂奶粉的1×TBST中室溫輕搖60 min以封閉非特異性結合位點。1×TBST洗3次、每次5 min。加入一抗(水腫相關蛋白兔抗血清，1∶1 000;β-actin羊抗血清為內參照，1∶2 000)在室溫下孵育1 h后，移去一抗，1×TBST洗3次，每次5 min。加入二抗(辣根過氧化物酶標記的抗羊和抗兔IgG，1∶5 000)在室溫下作用1 h，移去二抗，1×TBST浸洗3次。按 Amer對照Pharmacia公司手冊用增敏的化學發(fā)光底物(ECL)進行顯影。

2 結果

圖1 神經功能缺損評分

2.1 神經功能缺損評分和腦含水量 分別見圖1和圖2，模型組的神經功能缺損評分和腦含水量明顯高于對照組(P＜0.05)，表明模型制作成功。給藥組的神經功能缺損評分和腦含水量高于對照組(P＜0.05)，給藥組的神經功能缺損評分和腦含水量低于模型組(P＜0.05)，表明打擊能夠降低動物的神經功能缺損評分，但茶多酚能夠提高動物的神經功能評分。

2.2 BBB通透性 從圖3中可以看出模型組伊文氏藍含量高于對照組(P＜0.05)，表明打擊破壞了血腦屏障，增加了BBB通透性，而給藥組伊文氏藍含量明顯低于模型組(P＜0.05)，但又明顯高于對照組(P＜0.05)，表明給藥組能夠明顯減少BBB的開放程度，降低其通透性。

圖2 腦含水量

圖3 伊文氏藍含量

2.3 Western blot檢測結果 與對照組比較，模型組中AQP4/MMP-9蛋白表達有相似程度的增加(P＜0.05)，而給藥組與模型組相比AQP4/MMP-9蛋白表達減少(P＜0.05)見圖4和圖5。另外，給藥組AQP4/MMP-9蛋白表達高于對照組(P＜0.05)。這顯示打擊使得AQP4/MMP-9蛋白表達增加，但是茶多酚能夠降低AQP4/MMP-9蛋白的表達。

圖4 Western blot檢測結果

圖5 Western blot檢測結果

3 討論

外傷對腦組織的損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性顱腦創(chuàng)傷，繼發(fā)性的腦損傷包括腦出血和腦水腫，外傷后導致的腦水腫主要分為血管源性腦水腫和細胞性腦水腫。血管源性腦水腫的病理基礎是血腦屏障結構與功能的損害［6］，顱腦損傷后機械性損傷導致血腦屏障破壞，腦血管內皮細胞間的連續(xù)性中斷和內皮細胞內的胞飲小泡增加，導致毛細血管通透性增加，這樣血中大分子物質及水分就會從腦血管內滲出從而進入腦組織內，累積于腦細胞外間隙，從而導致了血管源性腦水腫，針對血管源性腦水腫的治療能夠減輕創(chuàng)傷對腦功能的影響［7］。

長期以來，人們一直認為水通過細胞膜的方式是通過單純擴散實現(xiàn)的，沒有特定的門控通道。然而隨著水通道蛋白(aquaporin，AQP)的發(fā)現(xiàn)顛覆了以往人們對細胞性腦水腫的認識。近年來的各種研究證明，AQP4在腦水腫中起到了重要的作用［8］，它主要分布于星形膠質細胞核室管膜細胞的質膜上，尤其大量分布于星形膠質細胞終突末端，參與形成圍繞毛細血管的血腦屏障，AQP4的位點表明其主要參與腦實質及腦脊液于腦微血管之間的水的運輸以及滲透壓的調節(jié)［9］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)Western blot結果顯示給藥組AQP4的表達明顯大于對照組，但是同時也明顯小于模型組，與前人的實驗結果基本一致。

顱腦外傷導致血管結構的改變激發(fā)了凝血機制的啟動，后者導致了快速的血管內反應，進而引起了血管內凝血及外傷周圍區(qū)域血流量顯著下降，在腦外傷模型中，BBB對大分子量蛋白的開放對腦組織病理生理功能的改變起到主要作用，而非腦血管壁的物理性損壞。血腦屏障是機體最重要的內部屏障之一，由腦毛細血管內皮細胞、基膜和膠質細胞足突共同組成［10］，血腦屏障功能的變化和緊密連接的開放與閉合有關，而緊密連接開放與否與相關蛋白表達關系密切。越來越多的證據表明matrix metalloproteinases，MMPs可以分解緊密連接復合體及降解基膜而破壞BBB的完整性，從而導致血管源性腦水腫的形成［11］大量的實驗表明抑制MMP-9的表達能夠減少血腦屏障的開放、減輕腦水腫［12－13］本實驗的結果發(fā)現(xiàn)給藥組的BBB破壞程度、水腫相關蛋白MMP-9明顯大于對照組，但是同時也明顯小于模型組。

現(xiàn)在的研究已經證實氧化應激在創(chuàng)傷性顱腦損傷所致的腦水腫中是重要的機制之一，我們推測茶多酚具有腦保護的作用可能通過其具有的強烈的抗氧化作用而產生的效果，茶多酚的抗氧化作用使得大鼠在經過創(chuàng)傷性顱腦損傷后，減少了水腫相關蛋白AQP4和MMP-9的表達，從而減輕腦水腫達到腦保護的作用。

4 結論

當給予大鼠腹腔注射茶多酚之后，我們發(fā)現(xiàn)茶多酚能夠明顯的降低水腫相關蛋白AOP4、MMP-9的表達，從而抑制腦水腫的發(fā)生發(fā)展，進而能夠減少大鼠血腦屏障的破壞，提高大鼠的神經功能表現(xiàn)，從而達到了腦保護的作用。

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