沉默miRNA-23a對UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞慢性光損傷的影響

張家安 周炳榮 胡燕燕 吳維 尹慧彬 張倩 郭嫻菲 駱丹

沉默miRNA-23a對UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞慢性光損傷的影響

張家安 周炳榮 胡燕燕 吳維 尹慧彬 張倩 郭嫻菲 駱丹

目的探討沉默miRNA-23a對UVB照射所致成纖維細(xì)胞慢性光損傷的影響。方法將成纖維細(xì)胞分為空白對照組、UVB光損傷組、miRNA-23a沉默組、UVB光損傷+miRNA-23a沉默組。SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)化學(xué)染色測定老化程度，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，實時PCR法檢測p53、p16、p21 mRNA的表達(dá)，免疫印跡法檢測p53、p16、p21的蛋白表達(dá)量。結(jié)果UVB光損傷組與UVB光損傷+miRNA-23a沉默組的SA-β-Gal細(xì)胞藍(lán)染陽性率分別為(94.60±2.58)%、(48.18±3.70)%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。G1期阻滯率分別為(85.06±1.52)%、(57.48±2.01)%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。UVB光損傷+miRNA-23a沉默組的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達(dá)量與UVB光損傷組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論沉默miRNA-23a對UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老有抑制作用，而miRNA-23a對下游衰老相關(guān)信號分子的抑制可能是其機(jī)制之一。

紫外線；成纖維細(xì)胞；微RNAs；細(xì)胞衰老

細(xì)胞衰老是一種永久性的增殖抑制狀態(tài)，中波紫外線照射等多種因素可誘導(dǎo)機(jī)體提前進(jìn)入衰老狀態(tài)，從而引起多種生物學(xué)指標(biāo)異常[1-2]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼單鏈小RNA分子，能夠通過與基因3'UTR區(qū)堿基不完全或完全配對而導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3-4]。研究顯示，miRNA-23a在維持正常細(xì)胞組織功能中起著重要的作用[5]。我們前期[6]對中波紫外線(UVB)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞提前衰老差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行了基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在接受劑量為50mJ/cm2的UVB照射24h后miRNA-23a的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)。我們通過沉默miRNA-23a，觀察光損傷成纖維細(xì)胞的各項生物學(xué)指標(biāo)，以了解其對光損傷進(jìn)程的影響，并探討其機(jī)制。

材料與方法

一、材料

成纖維細(xì)胞取自成年健康男性包皮組織。胰酶購于美國Amresco公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，小牛血清購于杭州四季清生物工程材料有限公司，細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，Trizol核酸提取液購于美國Invitrogen公司，miR-23a antagomir購于廣州銳博生物科技有限公司，實時熒光定量PCR試劑盒、p53、p16、p21抗體均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，UVB照射儀購于上海希格瑪高技術(shù)有限公司(ss-40，發(fā)射波長280～ 320 nm，波峰311 nm)。

二、方法

1.細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與傳代：包皮修剪去除皮下組織，剪成0.5 cm×0.5 cm皮塊，聚維酮碘浸泡，生理氯化鈉溶液沖洗3次，加入0.5%分散酶，4℃消化18～20 h后分離表、真皮。真皮部分以包皮消化液37℃消化5 min后，加入DMEM培養(yǎng)基，吹打、過濾，過濾后將細(xì)胞液離心，棄上清，加入含10%胎牛血清、雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，混勻并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，接種密度為1.0×106個/皿，取10～15代對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：成纖維細(xì)胞接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，用0.5 ml不含血清培養(yǎng)基稀釋 12.5 μl(20 μmol/L)miR-23a antagomir儲存液，輕輕混勻，室溫孵育5 min，同時用0.5 ml不含血清培養(yǎng)基稀釋1 μl LipofectamineTM2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min，將兩者輕輕混勻，室溫孵育20 min后，將其加入含有細(xì)胞的4 ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6 h后，移去miR-23a antagomir-LipofectamineTM2000混合液，更換為新鮮完全培養(yǎng)基，于72 h后使用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。

3.UVB照射：實驗分為4組?？瞻讓φ战M為未經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞；UVB光損傷組為UVB直接照射；miRNA-23a沉默組為單純 miRNA-23a antagomir轉(zhuǎn)染；UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組為先轉(zhuǎn)染，再予UVB照射。UVB照射方法參考文獻(xiàn)[6]，用UVB探測儀標(biāo)定UVB照射儀的照射度，UVB劑量 =UVB照射度×?xí)r間(s)，培養(yǎng)板距燈管距離15 cm，照射總劑量為50 mJ/cm2，分為5 d照射，每天 10 mJ/cm2。

4.細(xì)胞化學(xué)酶染色法檢測SA-β-Gal：末次照射后3 d，收集并檢測細(xì)胞。使用β半乳糖苷酶染色試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作及相關(guān)試劑配制：用PBS清洗各組細(xì)胞，加入適量SA-β-Gal染色固定液，用PBS清洗各組細(xì)胞3次，加入適量細(xì)胞染色工作液，在37℃孵育20 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察藍(lán)染陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取3～5個視野(×400)進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，統(tǒng)計陽性細(xì)胞百分率。

5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：末次UVB照射后3 d，用0.125%的胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，以75%乙醇固定，PBS清洗3次，去除乙醇。取出4℃保存的含50 mg/L Triton的碘化丙錠，于各試驗管中分別加入200 μl碘化丙錠，振蕩成單細(xì)胞懸液，避光室溫靜置30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

6.實時熒光定量PCR檢測成纖維細(xì)胞p53、p16、p21的mRNA表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理同前，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，取RNA樣品用1×TE緩沖液稀釋樣品100倍。測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量。計算RNA的濃度 =A260× 稀釋倍數(shù) × 0.04 μg/μl。取滅菌且無核酸酶的0.2 ml PCR管，依次加入實驗樣品RNA 1 μl，Oligo dT 2 μl，無核酸酶的雙蒸水至總體積 10 μl，70℃保溫10 min，然后冰浴5 min依次加入下列組分：RNase抑制劑(40 U/μl)，0.5 μl 10 × AMV 反應(yīng)緩沖液 2 μl dNTP 2 μl，MgCl24 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μl，無核酸酶的雙蒸水0.5 μl。輕輕混勻后，然后200×g離心20 s；先在42℃保溫60 min，然后95℃保溫5 min；上述產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，加入2×實時PCR Master Mix 10 μl，模板 1 μl，引物 MIX 2 μl，DEPC水7 μl，置于實時定量儀中并設(shè)置反應(yīng)參數(shù)。95℃、5 min，95 ℃、15、s，60 ℃、20 s，72 ℃、40 s共 40 個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物以Ct值作為分析依據(jù)。

7.Western 印跡檢測 p53、p16、p21 蛋白表達(dá)量：收集各實驗組細(xì)胞，蛋白提取液分別處理細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜，5%牛白蛋白PBS溶液常溫封閉2 h后，加入抗p53、p16、p21的一抗4℃孵育過夜，再加入二抗辣根過氧化酶標(biāo)記抗體，用封閉液稀釋(1∶5 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h。最后化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法顯帶，加入工作液1 min，直接上機(jī)，曝光3 min。用灰度分析軟件Image Tool3.00進(jìn)行條帶分析。

8.統(tǒng)計方法：用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，兩組間用成組t檢驗，多組間行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-23a antagomir轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞下調(diào)miR-23a的表達(dá)

miR-23a antagomir轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，用qRT-PCR法檢測miR-23a的相對表達(dá)量。與空白對照組(1.026 8±0.274 9)相比，miR-23a沉默組(0.000 8±0.000 1)的miR-23a的相對表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。

圖1 沉默miR-23a對UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞慢性光損傷指標(biāo)β-Gal表達(dá)率的影響(倒置顯微鏡下×40) β半乳糖苷酶染色，藍(lán)綠色細(xì)胞代表衰老細(xì)胞。1a：空白對照組；1b：UVB光損傷組；1c：miRNA-23a沉默組；1d：UVB光損傷+miRNA-23a沉默組

二、沉默miR-23a對UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞慢性光損傷指標(biāo)β-Gal表達(dá)率的影響

空白對照組β半乳糖苷酶染色陰性。UVB照射后，大部分細(xì)胞染色陽性(胞質(zhì)染為藍(lán)色)，占(94.6±2.58)%。而UVB+miRNA-23a沉默組細(xì)胞藍(lán)染面積明顯減少，與UVB光損傷組相比，其SA-β-Gal細(xì)胞藍(lán)染陽性率有明顯降低(48.18±3.70)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，n=3)，與 UVB 光損傷組相比，UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組陽性細(xì)胞少而淡染，見圖1。

三、沉默miR-23a對UVB誘導(dǎo)慢性光損傷成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

單純沉默miR-23a對G1期細(xì)胞沒有影響，與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；UVB光損傷組G1期細(xì)胞增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與UVB光損傷組相比，UVB光損傷+miRNA-23a沉默組G1期細(xì)胞阻滯率明顯下降(P＜0.05)，見圖2。

四、沉默miR-23a對UVB誘導(dǎo)慢性光損傷的成纖維細(xì)胞p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

圖2 沉默miR-23a對UVB誘導(dǎo)慢性光損傷成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響2a：空白對照組；2b：UVB光損傷組；2c：miRNA-23a沉默組；2d：UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組

經(jīng)Western印跡及實時PCR檢測顯示：與空白對照組相比，單純沉默mir-23a對成纖維細(xì)胞的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達(dá)沒有影響(均P＞0.05)，UVB 照射后 72 h 可見 p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯增加(均P＜0.05)。與UVB光損傷組比較，UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低(均P＜0.05)，見表 1，圖 3。

討 論

miRNA調(diào)控著超過三分之一的mRNAs，在基因表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用[7]。為驗證miRNA-23a在光損傷進(jìn)程中的作用，我們通過miRNA-23a antagomir轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)各組miRNA-23a的相對表達(dá)量，檢測多種與衰老相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)。miRNA-23a antagomir是經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的miRNA拮抗劑，通過與體內(nèi)的成熟miRNA強(qiáng)競爭性結(jié)合，阻止miRNA與其靶基因mRNA的互補(bǔ)配對，抑制miRNA發(fā)揮作用。其中，SA-β-Gal是在衰老過程中特異表達(dá)的酶，是最常用的鑒別衰老細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志；復(fù)制衰老的細(xì)胞生長停止于G1期。p53、p16、p21是衰老相關(guān)通路中3個重要的信號分子，p16可通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cycline dependent kinase，CDK)活性，使pRb蛋白去磷酸化，抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯于G1期，p21同樣可通過抑制CDK的活性，使pRb去磷酸化后與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1期，p53的表達(dá)上調(diào)和活化可直接引起細(xì)胞衰老，亦可通過p21/Rb通路引起衰老[8-10]。沉默mir-23a表達(dá)后再予UVB照射的成纖維細(xì)胞，其SA-β-Gal陽性率、G1期阻滯率、p53、p16、p21的 mRNA 及蛋白表達(dá)量較單純UVB照射，均出現(xiàn)明顯降低。這些結(jié)果表明沉默mir-23a對信號分子p53、p16、p21的下調(diào)作用，可能是抑制慢性光損傷的機(jī)制之一。

一些研究表明，miRNA-23a能夠促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞的生長并降低IL-6R的表達(dá)量[11]；在人胚腎細(xì)胞中，上調(diào)miRNA-23a～27a～24-2簇能夠促進(jìn)依賴或非依賴半胱氨酸的凋亡[12]；然而，在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，上調(diào)mir-23a卻有助于降低UVB照射引起的細(xì)胞凋亡，并有助于CPD的清除[13]。miRNA-23a在不同細(xì)胞中表現(xiàn)出的不同作用可能是因為在不同細(xì)胞中的生理功能不同。在我們前期的miRNA芯片結(jié)果中，mir-23a在光損傷模型中表達(dá)顯著增加。同時在經(jīng)UVB照射的小鼠上皮中，miRNA-23a也是上調(diào)的[6]，而沉默miRNA-23a對光損傷有著保護(hù)作用。

在UVB照射誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞慢性光損傷過程中，沉默miRNA-23a有著重要的保護(hù)作用。除miRNA-23a外，也存在著許多其他miRNAs，它們也對老化的進(jìn)程發(fā)揮著調(diào)控作用。隨著研究的深入，我們期待更多老化相關(guān)的miRNAs及其作用的靶基因和下游調(diào)控途徑被發(fā)現(xiàn)和闡明，不僅使我們對miRNA與老化之間的具體作用機(jī)制更加明了，也對老化的治療和預(yù)防提供了新的線索。

表1 UVB輻射后72 h各組p53、p16、p21 mRNA的相對表達(dá)量

圖3 Western印跡檢測p53、p16、p21結(jié)果 1：空白對照組；2：UVB組； 3：miRNA-23a沉默組； 4：UVB+miRNA-23a沉默組

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2013-03-04)

(本文編輯：吳曉初)

Effect of miRNA-23a silencing on ultraviolet B-induced chronic photodamage to fibroblasts

Zhang Jiaan，Zhou Bingrong，Hu Yanyan，Wu Wei，Yin Huibin，Zhang Qian，Guo Xianfei，Luo Dan.Department of Dermatology and Venereology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

Luo Dan，Email:daniluo2011@gmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of miRNA-23a silencing on ultraviolet B(UVB)-induced chronic photodamage to fibroblasts.MethodsFibroblasts from human foreskin were divided into four groups:blank control group receiving untreated，UVB group receiving UVB irradiation only，miRNA-23a group transfected with a miRNA-23a antagomir，UVB+miRNA-23a group receiving transfection with miRNA-23a antagomir followed by UVB irradiation.UVB irradiation was carried out once a day for five consecutive days at a dose of 10 mJ/cm2.Three days after the last irradiation，SA-β-galactosidase staining was performed to detect senescent cells，flow cytometry to analyze cell cycle，and real-time PCR and Western blot to measure the mRNA and protein expressions of p53，p16 and p21，respectively.ResultsBoth the percentage of β-galactosidase-positive cells and proportion of G1-phase cells were significantly higher in the UVB group than in the UVB+miRNA-23a group((94.60±2.58)%vs.(48.18±3.70)%，(85.06±1.52)%vs.(57.48±2.01)%，bothP＜0.05).Significant differences were observed in the mRNA and protein expressions of p53，p16 and p21 between the UVB group and UVB+miRNA-23a group(allP＜0.05).ConclusionsThe silencing of miRNA-23a may suppress UVB-induced chronic photodamage，which is likely to be associated with the inhibition of senescence-associated downstream signaling molecules.

Ultraviolet rays；Fibroblasts；MicroRNAs；Cell aging

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.006

國家自然科學(xué)基金(81000700、81171518)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012877)

210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科

駱丹，Email：daniluo2011@gmail.com