UBA3在黑素瘤細胞的表達及其影響黑素瘤細胞生物學行為的研究

程芳 何潤之 張磊 張韡 高偉 呂靜 孫建方

UBA3在黑素瘤細胞的表達及其影響黑素瘤細胞生物學行為的研究

程芳 何潤之 張磊 張韡 高偉 呂靜 孫建方

目的探討UBA3在黑素瘤細胞中的表達，初步觀察干擾UBA3對黑素瘤細胞生物學行為的影響。方法用RT-PCR技術(shù)觀察3株黑素瘤細胞中UBA3的表達，并利用siRNA技術(shù)對M14細胞中UBA3的表達進行干擾，檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)UBA3、連接態(tài)NEDD8以及p53的表達，并觀察轉(zhuǎn)染前后細胞的凋亡及遷移能力的改變。結(jié)果在A375、M14及MV3中UBA3的表達均較正常黑素細胞上調(diào)，其中M14細胞上調(diào)最明顯，成功干擾M14中UBA3的表達后，細胞內(nèi)連接態(tài)NEDD8的表達下降，p53的表達明顯增加，同時M14細胞凋亡增加、遷移能力下降。結(jié)論構(gòu)建的質(zhì)粒可干擾UBA3的表達，影響細胞的Nedd化進程，從而影響細胞的生物學行為。

黑色素瘤；泛素；UBA3；細胞凋亡；細胞運動

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)參與細胞內(nèi)蛋白降解的精密調(diào)節(jié)，與細胞周期的有序進行及細胞凋亡有著密切的聯(lián)系[1]。待降解蛋白被泛素標記的過程稱為蛋白的泛素化，泛素化的進行依賴于一系列酶的催化。神經(jīng)前體細胞表達發(fā)育下調(diào)蛋白-8(NEDD8)與底物的連接稱為類泛素化(Nedd化)，Nedd化的有序進行也需要被一系列酶催化，包括NEDD8激活酶、NEDD8連接酶和NEDD8結(jié)合酶。Nedd化與泛素化密切相關(guān)，通過一系列調(diào)節(jié)酶的作用促進泛素化進程[2]。UBA3是NEDD8激活酶的亞基，對于Nedd化的有序進行起著重要的作用，阻斷UBA3的表達，將會使Nedd化中斷，使蛋白的泛素化無法進行，從而影響腫瘤細胞的生物學行為，影響腫瘤的發(fā)展。我們觀察UBA3在黑素瘤細胞株中的表達情況，設計并合成針對UBA3的干擾質(zhì)粒，觀察干擾UBA3對Nedd化通路及泛素化通路的影響，初步探討其對黑素瘤細胞生物學行為的影響。

材料與方法

一、試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、M254培養(yǎng)基、HMGS、胎牛血清購自德國 Gibco公司。Trizol、G418購自美國Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司。Fugen HD試劑盒購自瑞士Roche公司。Hoechst 33258試劑購自南京凱基公司生物科技發(fā)展有限公司。抗UBA3抗體、NEDD8抗體、p53抗體及β肌動蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司。用于Transwell小室實驗的CytoSelect 24孔細胞移行實驗試劑盒購自美國Cell Biolabs公司。9700型GeneAmpPCR儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司。

二、細胞培養(yǎng)

黑素瘤細胞系A375由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院饋贈，M14、MV3購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。從健康男性包皮提取培養(yǎng)黑素細胞，將提取的原代細胞移至M254培養(yǎng)基(添加HMGS)進行培養(yǎng)傳代，經(jīng)S100免疫組化染色證實純度超過95%，實驗所用細胞均收于對數(shù)生長期。

三、實驗方法

1.引物設計：基因庫上查找UBA3的基因全序列，GeneID：9039，用Primer Premier 5.0軟件設計，并使用核算序列數(shù)據(jù)庫檢索程序排除其他的可能同源序列。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。引物序列為5'-GATGTTGCAGT GGCCTAAGGAG-3'；3'-GTGGCTGTGATGGCTGGA GATT-5'。

2.shRNA序列設計：用美國Ambion公司和德國Qiagen公司的siRNA設計軟件，設計siRNA序列3條，由南京金斯特公司合成雙鏈shRNA編碼序列。

3.RT-PCR檢測A375、M14及MV3中NEDD8相關(guān)蛋白的表達：對象為惡性黑素瘤細胞系A375、M14、MV3，以正常原代培養(yǎng)黑素細胞為對照。首先用Trizol提取各株細胞的總RNA，經(jīng)分光光度計檢測A260/A280比值在1.9～2.1之間，各樣本分別取總RNA 1 μg，用Oligo(dT)引物，按說明書推薦條件將其反轉(zhuǎn)為cDNA。擴增目的片段反應條件為：95℃2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán) 30 次；72℃10 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像儀下拍照。所有試驗重復3次。以UBA3的灰度值/β肌動蛋白灰度值表示目的基因的表達水平，采集3次實驗數(shù)據(jù)，計算目的基因表達水平的95%可信區(qū)間。

4.細胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：M14細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2。選擇對數(shù)生長期的細胞接種于24孔板，按照Fugen HD轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。初步篩選出的最佳轉(zhuǎn)染條件為：轉(zhuǎn)染的混合物比例為3∶2，轉(zhuǎn)染混合物的孵育時間為20 min，轉(zhuǎn)染后孵育48 h將其從24孔板上消化，接種入培養(yǎng)瓶。1 000 μg/ml的G418濃度為最終確定的篩選濃度，維持該濃度2周進行篩選。將篩選的細胞消化后，以較稀疏的密度重新接種。待接種的細胞形成克隆，且克隆間尚未發(fā)生融合時，在熒光顯微鏡下，用刮刀挑取陽性克隆，繼續(xù)培養(yǎng)于含G418 500 μg/ml的培養(yǎng)基中。

5.shRNA的選擇：帶有雙鏈shRNA的3組質(zhì)粒，以及空質(zhì)粒shRNAT-U6.2轉(zhuǎn)染M14細胞后，以Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)UBA3及連接態(tài)NEDD8的改變，選出具有最佳干擾效果的質(zhì)粒。

6.Western印跡實驗：取對數(shù)生長期的細胞，PBS洗滌細胞后，加入預冷的蛋白裂解液200 μl，冰上充分裂解40 min，高速離心后收集上清，考馬斯亮藍G-250法測定蛋白濃度。取70 μg蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗：抗UBA3抗體、NEDD8抗體及p53抗體，β肌動蛋白為內(nèi)參照，氧化物酶標記的鼠抗為二抗，TBST洗膜后加入ECL化學發(fā)光液，X線片暗室曝光、顯影及定影，Band-Scan 4.5軟件分析蛋白條帶。

7.Hoechst 33258細胞核染色法觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變：將轉(zhuǎn)染前后的M14細胞以1×104的濃度分別接種于24孔板，待細胞貼壁生長后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，加入40 g/L的多聚甲醛液固定10 min，吸去固定液，PBS清洗1次，加入5 mg/L的 Hoechst 33258，染色 10 min，用PBS清洗3次，自然干燥，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)，實驗重復3次。

8.Transwell實驗：分別取對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染M14細胞空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染M14細胞以及shRNAUBA3轉(zhuǎn)染M14細胞，以胰蛋白酶消化計數(shù)后，以無血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度為0.6×106/ml。將Transwell小室置入24孔板中，在小室中加入300 μl無血清培養(yǎng)基，室溫放置2 h，在小室外部加入含10%血清的培養(yǎng)基500 μl后，棄去小室內(nèi)部的無血清培養(yǎng)基，加入300 μl細胞懸液，孵育48 h。棄去小室內(nèi)的上清并輕拭去小室內(nèi)膜多聚碳酸酯膜上的細胞，小室置入含有500 μl染液的培養(yǎng)孔中染色20 min，以清水去除多余的染液，干燥后顯微鏡下計數(shù)穿過小室的細胞數(shù)，每組實驗重復3次。

9.統(tǒng)計學方法：用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，用t檢驗分析RT-PCR以及細胞遷移實驗數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 M14細胞轉(zhuǎn)染前后 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，表達GFP熒光蛋白的細胞達到95%以上，轉(zhuǎn)染空質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染帶有shRNA片段的質(zhì)粒對細胞的形態(tài)幾乎無影響 1a：轉(zhuǎn)染前M14細胞組(×200)；1b：shRNAT-U6.2轉(zhuǎn)染組(× 400)；1c：shRNA-UBA3轉(zhuǎn)染組(× 200)；1b、1d激發(fā)熒光前；1c、1e激發(fā)熒光后

結(jié) 果

一、黑素瘤細胞株中UBA3的表達

UBA3在正常黑素細胞株中表達極低，但是在黑素瘤細胞株A375、M14和MV3中的表達均較正常黑素細胞中的表達明顯升高(P＜0.05)，其中在M14中的表達最高，因此我們選擇M14進行進一步實驗。

二、轉(zhuǎn)染前后M14細胞內(nèi)UBA3表達的變化

經(jīng)過G418篩選及單克隆挑選后，表達GFP熒光蛋白的細胞達到95%以上，轉(zhuǎn)染空質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染帶有shRNA片段的質(zhì)粒對細胞的形態(tài)幾乎無影響(圖1)。用Western印跡檢測干擾前后細胞內(nèi)UBA3的蛋白表達量，選出一條最優(yōu)shRNA，序列為5'-GGATCCCGTGCACGCTGGAACTTTATCTTCAAGAG AGATAAAGTTCCAGCGTGCATTTTTTCCAACTCGA G-3'，其干擾效果如圖2所示，干擾后M14細胞中的UBA3明顯降低，干擾效果顯著。

圖2 轉(zhuǎn)染前后細胞中UBA3的表達 與未轉(zhuǎn)染組和空白轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組中UBA3的表達明顯下降。1：未轉(zhuǎn)染組M14(0.3845)；2：空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組shRNAT-U6.2(0.5314)；3：轉(zhuǎn)染組shRNA-UBA3(0.0206)

三、轉(zhuǎn)染前后M14細胞內(nèi)連接態(tài)NEDD8表達的變化

UBA3是NEDD8激活酶的亞基，是NEDD8被激活的第一步，干擾UBA3的表達將會使NEDD8與底物的連接受到影響，連接態(tài)NEDD8表達明顯下調(diào)，連接態(tài)NEDD8在蛋白電泳圖上表現(xiàn)為一系列條帶，其中最具有代表性的為95 000，其他相對分子質(zhì)量的電泳條帶在不同種類的標本中表現(xiàn)不同[3]。在實驗中干擾UBA3的表達后，伴隨UBA3的下調(diào)，連接態(tài)NEDD8的表達也明顯下降，如圖3所示。說明成功干擾UBA3的表達后細胞內(nèi)連接態(tài)NEDD8的形成將會受到影響。

圖3 轉(zhuǎn)染前后細胞中連接態(tài)NEDD8的表達 與未轉(zhuǎn)染組和空白轉(zhuǎn)染組相比，實驗組中連接態(tài)NEDD8(95 000)的表達明顯下降。1：未轉(zhuǎn)染組M14(0.8851)；2：空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組shRNAT-U6.2(0.9471)； 3：轉(zhuǎn)染組shRNA-UBA3(0.1037)

四、轉(zhuǎn)染前后M14細胞內(nèi)p53表達的變化

p53是通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)來進行降解的[4]，成功干擾UBA3的表達造成Nedd化通路的進行受阻后，p53的泛素化也將會受到影響，從而影響其降解，使其在細胞內(nèi)聚集。實驗中，伴隨UBA3表達的下降，不僅連接態(tài)NEDD8的表達下調(diào)，p53的表達也明顯上升，如圖4所示。證實通過干擾UBA3的表達成功影響Nedd化的進程后，p53的泛素化減少，降解減少。

五、轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡的形態(tài)學變化

如圖5所示，Hoechst33258細胞核染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后部分細胞出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集以及核碎裂的細胞凋亡特征，未轉(zhuǎn)染組以及空白轉(zhuǎn)染組細胞核呈橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，幾乎未見凋亡細胞。此結(jié)果表明干擾UBA3的表達將會使細胞凋亡增加。

圖4 轉(zhuǎn)染前后細胞中p53的表達，與未轉(zhuǎn)染組和空白轉(zhuǎn)染組相比，實驗組中p53的表達明顯增加。1：未轉(zhuǎn)染組M14(0.3995)；2：空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組shRNAT-U6.2(0.4057)；3：轉(zhuǎn)染組shRNA-UBA3(1.1583)

圖5 轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡的形態(tài)學變化 轉(zhuǎn)染后部分細胞出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集以及核碎裂(箭頭)，未轉(zhuǎn)染組以及空白轉(zhuǎn)染組細胞核呈橢圓形，染色質(zhì)分布均勻 5a：未轉(zhuǎn)染的M14細胞組；5b：shRNAT-U6.2組；5c：shRNA-UBA3組 圖6 M14細胞穿過人工基底膜 穿過多聚碳酸酯膜的細胞被染液染成紫色，與兩個對照組相比，實驗組穿膜細胞數(shù)明顯減少 6a：未轉(zhuǎn)染的M14細胞組；6b：shRNAT-U6.2組；6c：shRNA-UBA3 組

六、Transwell小室

小室的人工基底膜使細胞無法自由通過，只有具有遷移能力的細胞分泌水解酶破壞人工基底膜，再經(jīng)過細胞的變形通過微孔才能到達聚碳酸酯膜下表面。計數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)，可以用來研究細胞的遷移能力。如圖6所示，實驗組穿過人工基底膜的細胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組明顯降低。未轉(zhuǎn)組M14細胞的平均穿膜細胞數(shù)為(82.67±13.65)個/視野，M14/shRNAT-U6.2組平均穿膜細胞數(shù)為(69.33±22.28)個/視野，M14/shRNAUBA3組的平均穿膜細胞數(shù)為(18±8.54)個/視野，實驗組與兩個對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果表明干擾UBA3的表達，將會使M14細胞的遷移能力明顯下降。

討 論

NEDD8是一種類泛素蛋白，由81個氨基酸組成，與泛素有60%相同序列，有80%的同源性[5]。NEDD8對底物的修飾稱為Nedd化，Nedd化參與調(diào)解泛素化的進程，與泛素化的關(guān)系密切相關(guān)。近來新發(fā)現(xiàn)的小分子化合物MLN4924是一種NEDD8激活酶的阻斷劑，在一期臨床階段表現(xiàn)出了良好的促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[6]。這在一定程度上說明了NEDD8通路和腫瘤的密切關(guān)系。已證實NEDD8通路的上調(diào)與多種腫瘤相關(guān)。乳腺癌相關(guān)蛋白3(BCA3)是NEDD8修飾的底物之一，NEDD8可以對BCA3的第11個賴氨酸殘基進行修飾，修飾后的BCA3可以作為NFkB的共抑制者，抑制腫瘤壞死因子誘導的NFkB激活，抑制細胞凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)生[7]。另外研究者對口腔鱗癌、乳腺癌、大腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌等多種惡性增殖細胞株進行了細胞Nedd化的檢測，研究發(fā)現(xiàn)在這些惡性細胞株中連接態(tài)NEDD8均有升高，且強度與細胞的增殖能力呈正相關(guān)[8]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)黑素瘤中Nedd化也出現(xiàn)了上調(diào)[3]，因此希望通過對該通路進行阻斷，發(fā)現(xiàn)黑素瘤新的治療途徑。

UBA3是NEDD8特異性激活酶E1(APP-BP1/UBA3二聚體)的重要組成部分，是NEDD8激活的第一步，NEDD8羧基末端的甘氨酸殘基在這一過程中與UBA3的半胱氨酸結(jié)合形成高能硫酯鍵；第二步NEDD8由E1傳遞到NEDD8特異性的連接酶E2，即UBC12，與UBC12的半胱氨酸形成硫酯鍵。最后在結(jié)合酶E3的幫助下激活的NEDD8以其羧基末端的甘氨酸與底物連接[9]，如Cullins蛋白，當Cullins蛋白發(fā)生Nedd化后，其空間構(gòu)像發(fā)生改變，可以促進泛素鏈向底物轉(zhuǎn)移，促進底物的泛素化[10]，從而使p53、p21、cyclin D、bax等通過泛素途徑降解的細胞周期或凋亡調(diào)節(jié)蛋白降解加速。

利用RNAi技術(shù)阻斷UBA3的表達可以抑制Nedd化的進行，從而影響細胞周期蛋白及凋亡因子等的泛素化及其降解過程，影響腫瘤的生物學行為。在本實驗中，我們首先利用RT-PCR技術(shù)觀察3株黑素瘤細胞株中UBA3的表達上調(diào)，其中M14細胞株中UBA3的表達上調(diào)最明顯，故選擇該細胞株進行后續(xù)試驗。利用RNAi干擾技術(shù)下調(diào)了UBA3的表達，實驗觀察到伴隨UBA3的表達下降，連接態(tài)NEDD8的表達也明顯下調(diào)，證實了UBA3作為NEDD8激活酶的重要亞基對整個Nedd化通路的影響，Nedd化通路的順利進行是泛素-蛋白體系統(tǒng)有序運行的保證，伴隨連接態(tài)NEDD8的下調(diào)，蛋白的泛素化也將受到影響。p53是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)來進行降解的蛋白，干擾UBA3后，p53表達的上調(diào)證實了蛋白的泛素化受到干擾，降解減少，同時也明確了我們構(gòu)建的質(zhì)粒對UBA3表達的干擾效果。

p53的表達與腫瘤細胞的凋亡密切相關(guān)，實驗中我們進一步觀察了干擾后細胞的凋亡情況，經(jīng)過Hoechst33258細胞核染色后，轉(zhuǎn)染組部分細胞出現(xiàn)明顯的核固縮、染色質(zhì)凝集以及核碎裂，這些均為細胞凋亡的典型表現(xiàn)，而未轉(zhuǎn)染組以及空白轉(zhuǎn)染組細胞核呈橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，幾乎未見凋亡細胞。本實驗不僅證實干擾UBA3的表達后，細胞凋亡增加，也說明我們選擇的空白質(zhì)粒對細胞的的影響很小，適于后續(xù)研究。

Transwell小室實驗主要用來觀察細胞的遷移能力，小室的的底部為一張具有通透性的多孔聚碳酸酯濾膜，類似基底膜的結(jié)構(gòu)，使細胞不能自由通過，具有遷移能力的細胞分泌水解酶破壞人工基底膜后，再經(jīng)過細胞的變形才能通過微孔到達聚碳酸酯膜下表面。計數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)，可以用來判斷細胞的遷移能力如何。本實驗中，實驗組到達聚碳酸酯膜下表面的細胞數(shù)較兩個對照組均明顯下降，反映了干擾UBA3可以對細胞遷移能力產(chǎn)生影響。本實驗通過RT-PCR技術(shù)觀察到黑素瘤細胞株中UBA3上調(diào)明顯，利用RNAi技術(shù)對M14細胞株中UBA3的表達進行了干擾，觀察到轉(zhuǎn)染后M14細胞凋亡增加，遷移能力下降，深入的作用機制尚需進一步研究。

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2013-08-30)

(本文編輯：吳曉初)

Expression of ubiquitin-like modifier activating enzyme 3 in melanoma cells and its effect on the biological behavior of melanoma cells

Cheng Fang*，He Runzhi，Zhang Lei，Zhang Wei，Gao Wei，Lyu Jing，Sun Jianfang.*Xingtai People's Hospital，Xingtai 054001，Hebei，China

Sun Jianfang，Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo detect the expression of ubiquitin-like modifier activating enzyme 3(UBA3)in melanoma cells，and to estimate the effect of RNA interference in UBA3 expression on the biological behavior of melanoma cells.MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)was performed to detect the expression of UBA3 in three melanoma cell lines(A375，M14 and MV3)and normal melanocytes from healthy human foreskin.Three short hairpin RNAs(shRNAs)targeting the UBA3 gene were designed and synthesized.To select the most efficient shRNA，some M14 cells were transfected with constructed plasmids containing the three shRNAs separately and an empty plasmid respectively followed by the determination of UBA3 and NEDD8(neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 8)expression by Western blot.Then，some M14 cells were divided into two groups to be transfected with the selected shRNA-containing plasmid(shRNA-UBA3)and an empty plasmid respectively，with untransfected cells serving as the control.Subsequently，the expression of p53 was measured by Western blot，cell apoptosis detected by Hoechest 33258 nuclear staining，and migration activity evaluated by Transwell assay.ResultsThe expression of UBA3 was significantly up-regulated in all the three melanoma cell lines，especially in M14 cells，compared with the normal melanocytes.In comparison with the M14 cells remaining untransfected and transfected with the empty plasmid，those transfected with shRNA-UBA3 showed an obvious decrease in the expression of NEDD8 ligated to proteins and migratory activity(allP＜0.05)，but an increase in p53 expression and cell apoptosis.ConclusionsThe shRNA-UBA3 eukaryotic expression plasmid constructed in this study could efficiently interfere in the expression of UBA3，affect the neddylation process，and influence the biological behavior of M14 cells.

Melanoma；Ubiquitin；Ubiquitin-like modifier activating enzyme 3；Apoptosis；Cell movement

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.004

國家自然科學基金(81272992)；江蘇省自然科學基金(BK20131063)；河北省邢臺市科技計劃項目(2012ZC184)

054001河北省邢臺市人民醫(yī)院(程芳、何潤之、高偉、呂靜)；江西省皮膚病醫(yī)院(張磊)；中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所(張韡、孫建方)

孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com