法舒地爾抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕2型糖尿病大鼠心肌纖維化

李貴芝，周 紅，房彩霞，張力輝，王 綿，王瑞英

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊050000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)的主要病理改變之一是心肌纖維化，最后導(dǎo)致心功能減退、最終發(fā)生心功能衰竭［1］。而引起心肌損傷的關(guān)鍵是氧化應(yīng)激(oxidative stress)的增強［2］。eNOS在調(diào)節(jié)心肌細胞功能中發(fā)揮重要作用。eNOS可減緩心肌損傷后的心肌重塑，發(fā)揮心肌保護作用［3］。RhoA是Rho蛋白家族的重要成員之一，Rho激酶(Rho kinase，ROCK)是最早發(fā)現(xiàn)的RhoA下游效應(yīng)器。研究表明RhoA/ROCK信號通路在多種糖尿病慢性并發(fā)癥中起著重要作用［4］。RhoA過度表達可導(dǎo)致心肌肥厚、心血管重塑、心肌收縮功能下降及心力衰竭［5］。目前RhoA/ROCK通路在高血糖狀態(tài)下對心肌氧化應(yīng)激的影響尚未見報道。本實驗建立2型糖尿病大鼠模型，采用ROCK抑制劑法舒地爾(fasudil)進行干預(yù)，觀察心肌上RhoA/ROCK信號通路對氧化應(yīng)激及eNOS表達的影響，探討糖尿病心肌損傷可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雌性SD大鼠42只，體質(zhì)量180～200 g，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供［許可證號:SCXK(冀)2012-1-003，動物質(zhì)量合格證編號:1010399］自由進食水，按清潔級大鼠要求飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

鹽酸法舒地爾注射液(天津紅日藥業(yè)有限公司);鏈脲佐菌素(Sigma公司);125I胰島素放射免疫分析藥盒(濰坊三維生物工程有限公司);羥脯氨酸、SOD和MDA試劑盒(均南京建成生物有限公司);Folin酚試劑(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司);蛋白磷酸酶抑制劑復(fù)合物(北京博邁德科技發(fā)展有限公司);兔抗大鼠磷酸化MYPT1(Thr853)抗體(Cell Signaling公司);兔抗大鼠磷酸化MYPT1(Thr696)多克隆抗體和小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司);兔抗大鼠MYPT1抗體和兔抗大鼠eNOS抗體(均Bioworld生物公司);山羊抗兔熒光二抗和山羊抗小鼠熒光二抗(Rockland公司);其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.3 主要方法

1.3.1 動物模型的建立:研究建立2型糖尿病模型［6］，10周末根據(jù)參考文獻［7］建立的高胰島素正常血糖嵌夾技術(shù)測葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)反映大鼠胰島素抵抗情況，取血測FINS、FBG、TC、TG和BW。后將大鼠分為 NC組、DM組和DF組(每天腹腔注射10 mg/kg，分兩次注射)。第24周末，腹主靜脈取血測定 FINS、FBG、TC、TG和HbA1c。并根據(jù)公式測胰島素抵抗指數(shù) HOMAIR=FBG*FINS/22.5。取出心臟，稱取心臟質(zhì)量(HW)，計算心臟與體質(zhì)量的比值(HW/BW)。取左心室部分組織，用4%多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，后一部分心肌組織經(jīng)HE染色于顯微鏡下觀察組織病理結(jié)構(gòu)。另一部分心肌組織切片經(jīng)Masson染色，觀察膠原沉積情況。取左心室小片組織，置于4%戊二醛固定用于電鏡觀察心肌的超微結(jié)構(gòu)部分。

1.3.2 心肌組織羥脯氨酸(HYP)含量、MDA含量和SOD活力的測定:均按試劑盒的步驟進行操作，羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量占膠原蛋白的13.4%，將心肌HYP水平換算為心肌膠原(myocardial tissue collagen content，MCC)含量(μg/mg 組織)。

1.3.3 心肌組織eNOS免疫組織化學染色:標本固定，脫水、石蠟包埋和制片，兔抗大鼠eNOS抗體為一抗，按試劑盒說明進行染色，DBA染色，復(fù)染蘇木素，梯度乙醇脫水，脫水封片。陰性對照Ⅰ抗用PBS代替，余步驟同上。如果細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)有棕黃色粗或細顆粒彌漫分布者為陽性反應(yīng)。

1.3.4 Western blot方法檢測p-MYPT1表達:心肌組織勻漿，提取蛋白、電泳和轉(zhuǎn)膜。分別加入一抗1∶1 000稀釋。TBS洗去未結(jié)合的一抗，振蕩洗膜3次，每次10 min，加入熒光二抗，封閉1 h。TBS終止染色，照相。結(jié)束后應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描。心肌組織中磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位1(phosphorylation myosin phosphatase targets subunit-1，MYPT1)是ROCK的主要底物之一，用p-MYPT1來反應(yīng)ROCK的活性。MYPT1磷酸化水平以p-MYPT1與MYPT1的吸光度比值表示)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 BW、HW和HW/BW變化

第10周末，糖尿病大鼠體質(zhì)量顯著高于對照組(p＜0.05)(表1)。第24周末，糖尿病組大鼠體質(zhì)量顯著低于對照組(p＜0.05);對照組較法舒地爾干預(yù)組體質(zhì)量顯著升高(p＜0.05)。糖尿病組大鼠的HW及HW/BW較對照組大鼠顯著增加(p＜0.01，p＜0.01);法舒地爾干預(yù)組大鼠較糖尿病組大鼠上述指標顯著降低(p＜0.01，p＜0.01)(表2)。

2.2 血生化指標的變化

第10周末，糖尿病大鼠空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)顯著高于同期對照組大鼠(p＜0.01，p＜0.05)，(表1)。第24周末，糖尿病組大鼠FINS、FBG、糖化血紅蛋白(HbA1c)、TG和TC均顯著高于同期對照組大鼠(p＜0.01)，與法舒地爾干預(yù)組相比無明顯差異(表3)。3組大鼠的血壓無明顯差異分別為(16.4±0.4)kPa，(16.5±0.4)kPa及(16.1±0.5)kPa。

2.3 血糖鉗夾實驗和HOMA-IR

在第10周末，糖尿病組大鼠的GIR顯著低于對照組大鼠(p＜0.01)(表1)。第24周末，糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的HOMA-IR顯著高于對照組(p＜0.01);糖尿病組和法舒地爾干預(yù)組大鼠的HOMA-IR無明顯差異(表3)。

表1 10周各組大鼠生化、GIR和體質(zhì)量Table 1 Changes of biochemical index，GIR and BW at week 10(x±s，n=6)

表2 24周各組體質(zhì)量、心臟質(zhì)量和心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值及SOD活力、MDA含量和MCC結(jié)果Table 2 BW，HW，HW/BW，SOD，MDA and MCC in each group at week 24(x ± s，n=8)

2.4 心肌形態(tài)學變化

2.4.1 HE染色結(jié)果:第24周末，對照組大鼠心肌纖維間排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚。間質(zhì)可見少量成纖維細胞;糖尿病大鼠心肌纖維間排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清晰，間質(zhì)中成纖維細胞增多;法舒地爾干預(yù)組大鼠較糖尿病組上述異常改變明顯減輕。

2.4.2 心肌超微結(jié)構(gòu)的改變:對照組大鼠心肌間質(zhì)及肌原纖維結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，間質(zhì)膠原含量較少，線粒體形態(tài)正常;糖尿病組大鼠心肌間質(zhì)及肌原纖維增粗，結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)膠原含量增多，肌節(jié)結(jié)構(gòu)破壞;法舒地爾干預(yù)組較糖尿病組大鼠異常改變明顯減輕。

2.4.3 Masson染色結(jié)果:糖尿病組大鼠心肌間質(zhì)及血管周圍膠原為11.23%±0.63%顯著高于對照組的3.34%±0.45%(p＜0.01)。法舒地爾干預(yù)組為3.31% ±0.23%顯著低于糖尿病組(p＜0.01)(圖1)。

2.5 心肌SOD活力、MAD含量和MCC含量

糖尿病組大鼠心肌組織的SOD活力顯著低于對照組(p＜0.01);法舒地爾干預(yù)組SOD活力顯著高于糖尿病組(p＜0.01)，但仍低于對照組(p＜0.05)。糖尿病組MDA含量顯著高于對照組(p＜0.01)，法舒地爾干預(yù)組MDA含量顯著低于糖尿病組(p＜0.05)。糖尿病組大鼠的心肌膠原含量顯著高于對照組(p＜0.01)。法舒地爾干預(yù)組顯著低于糖尿病組(p＜0.01)(表2)。

2.6 心肌eNOS免疫組化染色結(jié)果

糖尿病組大鼠心肌eNOS陽性反應(yīng)率為67.25%±12.13%顯著低于對照組的103.78%±9.75%，(p＜0.01);法舒地爾干預(yù)組為94.56% ±10.23%顯著高于糖尿病組(p＜0.05)(圖2)。

2.7 磷酸化MYPT1水平

糖尿病組大鼠心肌組織中p-MYPT1顯著高于對照組(p＜0.01)，法舒地爾干預(yù)組大鼠心肌組織中p-MYPT1顯著低于糖尿病組(p＜0.01)(圖3)。

圖1 NC組、DM組和DF組的Masson染色結(jié)果Fig 1 The myocaidial in masson-stained of control group(NC)，diabetes group(DM)and diabetes with fasudil group(DF)［magnification(×400)］

圖2 NC組、DM組和DF組的eNOS免疫組化結(jié)果Fig 2 Immunohistochemistry staining for eNOSin the heart of control group(NC)，diabetes group(DM)and diabetes with fasudil group(DF)［magnification(×400)］

圖3 NC組、DM組和DF組大鼠心肌p-MYPT1的水平Fig 3 The level of myocardial p-MYPT1 protein expression in control group(NC)，diabetes group(DM)and diabetes with fasudil group(DF)(n=8)

3 討論

心臟的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和心肌纖維化以及心肌細胞凋亡促使了DC的形成［8］。氧化應(yīng)激是指活性分子如活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的過度生成增加或清除減少而抗氧化酶如SOD活性減少所致。MDA為脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物可間接反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度［9］。eNOS可減緩心肌損傷后的心肌重塑，發(fā)揮心肌保護作用。本研究結(jié)果顯示糖尿病大鼠心肌組織的MDA含量增加，而SOD活力降低，eNOS表達明顯減少，表明心肌在高糖環(huán)境中氧化應(yīng)激增強，保護效應(yīng)減弱，導(dǎo)致了心肌損害和間質(zhì)膠原增生等組織結(jié)構(gòu)改變。

Rho蛋白為小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白，它能結(jié)合并水解鳥苷酸，使其在活性型(GTP結(jié)合)與失活型(GDP結(jié)合)之間循環(huán)從而起著“分子開關(guān)”的作用。ROCK是最早發(fā)現(xiàn)、最具特色的RhoA下游效應(yīng)器。RhoA/ROCK信號通路調(diào)節(jié)著細胞的收縮、黏附、增殖和凋亡等多種生物學行為和功能。目前廣泛應(yīng)用的ROCK抑制劑主要有法舒地爾和Y-27632，法舒地爾是目前唯一可以應(yīng)用于臨床的ROCK抑制劑。它們主要作用于ROCK的ATP依賴的激酶區(qū)域，從而抑制ROCK的活性。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病使心肌RhoA上調(diào)，導(dǎo)致ROCK的底物磷酸化水平升高，增加了肌動蛋白微絲骨架的聚合，致使心肌收縮功能受損，引發(fā)心肌功能障礙，抑制ROCK可以改善其心肌功能［10］。糖尿病腎病的研究證實，ROCK抑制劑是通過抗氧化作用抑制糖尿病腎纖維化［11］。ROCK活性增強可以通過抑制eNOSmRNA生成而使eNOS的表達下調(diào)，而ROCK抑制劑可以上調(diào)eNOS的表達［12］，這與本實驗的研究結(jié)果一致。這些結(jié)果表明高血糖激活了心肌RhoA/ROCK信號通路，參與了氧化應(yīng)激過程，同時下調(diào)了心肌細胞保護因子eNOS表達，導(dǎo)致了心肌纖維化的發(fā)生。

本研究證實了RhoA/ROCK信號通路在2型糖尿病大鼠心肌氧化應(yīng)激和纖維化中的作用以及法舒地爾的心肌保護效應(yīng)，為更好地理解和治療糖尿病心肌病變提供了可能的理論依據(jù)。

［1］劉麗華，房彩霞，鄧永貴，等．JNK信號通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細胞［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2013，33:200－201．

［2］Aksakal E，Akaras N，Kurt M，et al．The role of oxidative stress in diabetic cardiomyopathy:an experimental study［J］．Med Pharmacol Sci，2011，15:1241 －1246．

［3］Umar S，vander Laarse A．Nitric oxide and nitric oxide synthase isoforms in the normal，hypertrophic and failing heart［J］．Mol Cell Biochem，2010，333:191－201．

［4］Zhou H，Li YJ．Long-term diabetic complications may be ameliorated by targeting Rho kinase［J］．Diabetes Metab Res Rev，2011，27:318 －330．

［5］Mihtante JD，Lombardini JB，Schaffer SW，et al．The role of tanrine in the pathogenesis of the cardiomyopathy of insulin dependent diabetes mellitus［J］．Cardiovasc Res，2002，46:393－402．

［6］ Zhou H，Li YJ，Wang M，et al．Involvement of RhoA/ROCK in myocardial fibrosis in a rat model of type 2 diabetes［J］． Acta Pharmacologica Sinica， 2011， 32:999－1008．

［7］DeFronzo RA，Tobin JD，Andres R．Glucose clamp technique:a method for quantifying insulin secretion and resistance［J］．Am JPhysiol，1979，237:214 －223．

［8］Van Linthout S，Spillmann F，Riad A，et al．Human apolipoprotein A－I gene transfer reduces the development of experimental diabetic cardiomyopathy［J］．Circulation，2008，117:1563－1573．

［9］Yoshida H，Kisugi R．Mechanisms of LDL oxidation［J］．Clinica Chimica Acta，2010，411:1875 －1882．

［10］Soliman H，Craig GP，Nagareddy P，et al．Role of inducible nitric oxide synthase in induction of RhoA expression in hearts from diabetic rats［J］．Cardiovasc Res，2008，79:322－330．

［11］GoJO A，Utsunomiya K，Taniguchi K，et al．The Rho-kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats［J］．Eur J Pharmacol，2007，568:242－247．

［12］Gojo A，Utsunomiya K，Taniguchi K，et al．Rho-kinase mediates hypoxia-induced downregulation of endothelial nitric oxide synthase［J］．Circulation，2002，106:57－62．